做WB前外泌体处理

yuantingdong

请教一下，外泌体抽提后做WB，但不是立马做，是用PBS溶解放-80°C保存吗？如果这样，在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来？谢谢！

atropine90

步步唧唧 发表于 2017-6-29 11:05
版主 问一下 提取到的外泌体跑WB，是exo直接加缓冲液煮，然后直接做跑WB吗？那不是所有蛋白都会跑出来吗 ...

感觉这位层主连WB的原理都不清楚啊.... 敷抗体啊！

shuhun

请问用试剂盒提取的外泌体如何做WB

yuantingdong

hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

请问版主，加loading煮了之后直接上样吗？我第一次听说可以这样，不提蛋白如何做WB，望不吝赐教！谢谢

hzangs

yuantingdong 发表于 2016-10-19 16:51
但是重悬在PBS中后，就必须得超离后才能提蛋白，不能直接处理，问题是我这边不能超离，那是不是就得分开 ...

不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

步步唧唧

hzangs 发表于 2017-6-21 12:33
嗯嗯

版主 问一下 提取到的外泌体跑WB，是exo直接加缓冲液煮，然后直接做跑WB吗？那不是所有蛋白都会跑出来吗？怎么鉴定标志戴白CD9\CD63\TSG101什么的啊？如何区分？用什么Marker

hzangs

一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的

yuantingdong

hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

我们这边超速离心不方便，那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白？谢谢！

君扬2009

hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

斑竹   我看06年Thery的文章说 从人来源分离的外泌体时，裂解液不加DTT和巯基乙醇。请问你们一般用的是什么裂解液呢？还有就是论坛下载的06年Thery的文献只有29页，是不是还有补充呢？谢谢

hzangs

yuantingdong 发表于 2016-10-19 10:06
我们这边超速离心不方便，那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白？谢谢！ ...

一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中，取部分做蛋白定量，然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取一部分 加6*loading 煮

yuantingdong

hzangs 发表于 2016-10-19 14:42
一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中，取部分做蛋白定量，然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取 ...

但是重悬在PBS中后，就必须得超离后才能提蛋白，不能直接处理，问题是我这边不能超离，那是不是就得分开做？

wxz

提外泌体蛋白不用裂解液么。先前我用RIPA感觉裂的不是很彻底，打算换4%的SDS呢。看好多文献直接加P
BS

yuantingdong

hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

版主有没有具体的步骤或者其链接或者文献，最近要做这个，谢谢了！