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第一次超离心WB结果,求大神帮忙看一看

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发表于 2016-5-26 16:20:28 | 显示全部楼层 |阅读模式
第一次用超离心分离exo,离心程序2000g 20min-10000g 30min-100000g 2h-100000g 2h,离心后沉淀很少,用80ulPBS重悬后,加入loading buffer,95度 5min煮,然后按6ul 8ul 10ul上样,用calnexin、TSG101、CD9杂条带,结果可以看到,cal仍然存在说明exo不纯,TSG101显出了条带,但CD9完全没有显出(CD9抗体之前有用别的蛋白验证过,没有问题)。想求问一下各位大神,超离心后的exo的WB是否可以做出干净的条带(无阴性marker)?或者是需要进一步纯化才行?另外,我之前试过小鼠血清提取的exo,CD9也很淡;这次用的是CHO细胞,完全没有CD9,是不是CD9在这些exo可能没有表达?谢谢!!

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发表于 2016-6-1 19:04:31 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-5-27 15:34
你不杂cell lysis  
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了, 而你不告诉这一堆水果总共有多少个 ...

请问版主你怎么保证外泌体和细胞上的蛋白量相同,BCA不是很精确,内参选什么?
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发表于 2016-5-26 20:12:55 | 显示全部楼层
你这个怎么没有 cell lysis的对照……   没有细胞对照   不好讲啊……
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 楼主| 发表于 2016-5-27 15:19:46 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-5-26 20:12
你这个怎么没有 cell lysis的对照……   没有细胞对照   不好讲啊……

因为是第一次超离,我的培养基还是多次收集的,想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的exo的纯度吗?分离的exo的阴性marker要怎样才能除去呢?请前辈赐教。
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发表于 2016-5-27 15:30:34 | 显示全部楼层
dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离,我的培养基还是多次收集的,想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

这个我不太清楚。  你最好还是要杂一下 cell lysis    这样才能大概反映出 你的样品里 不是exosomes的组分影响大概有多大。  不然 你这个没办法评判啊……
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发表于 2016-5-27 15:34:33 | 显示全部楼层
dengsilong1991 发表于 2016-5-27 15:19
因为是第一次超离,我的培养基还是多次收集的,想看看离心所得物怎么样。cell lysis的对照可以反应分离的 ...

你不杂cell lysis  
就好比告诉我你发现一堆水果里有几个水果是坏了, 而你不告诉这一堆水果总共有多少个。
如果只有10个果子, 几个坏了 那确实说明有问题。如果数千个果子 只有几个坏了, 那没事啊。

如果你杂cell lysis   和exosomes样品上同样的蛋白量。  发现 阴性marker在cell lysis里已经过曝了,而exosomes样品里只有一点点, 那就说明 你的污染不是很重, 直接忽视就好。 而如果两者接近,那就说明污染很严重,样品不能当做exosomes样品了。
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 楼主| 发表于 2016-5-27 15:34:43 | 显示全部楼层
恩,好的,我这次离心把cell也带上,谢谢前辈!
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发表于 2016-6-22 20:35:30 | 显示全部楼层
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体,才能保证做western的量?谢谢!
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发表于 2016-6-22 20:37:21 | 显示全部楼层
请问您是80ul PBS重悬外泌体后,直接加loading 煮的,没有经过裂解液提取蛋白那一步吗?
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 楼主| 发表于 2016-6-23 09:32:40 | 显示全部楼层
小孔加油 发表于 2016-6-22 20:35
请问您一次超离多少培养基得到的外泌体,才能保证做western的量?谢谢!

我也才超离过三次,前两次是60ml离心,80ul溶解,直接loading buffer煮后,10ul上样,能见条带
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