外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

 找回密码
 立即注册
查看: 117|回复: 0

Nature子刊:外泌体的活细胞荧光成像

[复制链接]

178

主题

196

帖子

6103

积分

管理员

Rank: 9Rank: 9Rank: 9

积分
6103
发表于 2020-5-7 22:06:18 | 显示全部楼层 |阅读模式
Nature子刊:外泌体的活细胞荧光成像用于外泌体分泌和细胞迁移的可视化

活细胞下的外泌体成像报告标志物pHluorin-CD63可以动态监测细胞迁移、扩散和外泌体的分泌。但是存在荧光微弱和无法稳定表达,限制了该标志物的使用。近日,美国范德堡大学医学院的研究人员在pHluorin中引入了稳定的M153R突变,突变后的pHluorin-CD63表现为更高、更稳定的表达,并能更好地监测外泌体分泌,可能会成为了解外泌体自分泌和旁分泌作用的有用工具。该研究发表于Nature Communications杂志上。

细胞外囊泡(EVs)是从细胞中释放出来的纳米级囊泡,具有强大的自分泌和旁分泌生物学活性。尽管EV最初被认为是不具有生物学相关性的细胞碎片,但现在EV已被认为构成了一种细胞间通信的基本模式,可在各种情况下介导特定蛋白质、核酸和脂质转运到受体细胞中。因此,EV参与多种疾病的发病机理,包括感染、神经退行性疾病、心血管疾病和癌症等。

细胞外囊泡可以通过其大小、生物发生机理、内容货物和密度来分类。小EV(包括外泌体)和大EV(如脱落的微囊泡MVs和大的oncosomes)。外泌体是直径为50-150 nm的小EV的一种,关于外泌体参与EV功能的研究最多。外泌体在称为多囊体(MVBs)晚期的内体细胞器中形成为腔内囊泡(ILV),并在MVB与质膜融合后分泌到细胞外。目前已经提出了几种外泌体的生物发生过程,包括通过转运必需内体分选复合物系统(ESCRT)捕获被泛素化的货物。比如,Syndecan和syntenin复合物可以通过ESCRT辅助蛋白Alix调节外泌体的生物发生。此外还存在着不依赖于ESCRT的外泌体生物发生机制,该机制涉及中性鞘磷脂酶2(nSMase2)产生的神经酰胺诱导的细胞膜弯曲。四次跨膜蛋白(例如CD9、CD63和CD81)是外泌体和其他小EV的常用标记物,可能与ILV货物选择或生物发生有关。

CD63是四次跨膜蛋白超家族的成员,在晚期胞内MVB中的ILV高度富集,并且是广泛使用的经典外泌体标记物。CRISPR / Cas9敲除CD63的表达会减少小EV的分泌,但不会影响大EV的分泌,表明CD63有助于外泌体的生物发生。在许多研究中,CD63已被用于标记和追踪外泌体和MVB。但是,大多数以前的研究都使用了对pH不敏感的荧光蛋白,例如GFP或RFP,可以看到胞内体内部的极亮荧光。由于较差的信噪比,这种明亮的内部荧光限制了观察MVB与质膜融合的过程。

为了解决这个问题,研究人员采用了突触囊泡领域的一种方法,该方法利用了pH敏感的GFP衍生物pHluorin来观察动态囊泡融合过程。pHluorin在酸性条件下实际上是无荧光的,但在中性pH时发出荧光,因此使其成为观察酸性晚期胞内MVB与质膜融合的理想报告分子。由于细胞外部环境处于中性pH,因此在融合过程中会发生酸到中性的转换。研究人员在此之前开发了用pHluorin标记的CD63报告基因来追踪外泌体的分泌,并用pHluorin-CD63来证明MVB融合比扩散细胞中的黏附形成要早1-2 min。研究人员还观察到了pHluorin-CD63阳性粘附痕迹留在迁移细胞的后面。此后,有其他研究也报道了pHluorin-CD63被用于研究G蛋白偶联受体信号传导对外泌体分泌的调节。

pHluorin-CD63是追踪外泌体分泌和MVB与质膜融合的有力工具。但是,尽管此构建体可用于具有高分辨率成像的二维(2D)组织培养条件下使用,但一部分pHluorin在细胞中易于降解,从而导致低水平的表达和快速的光漂白。因此,研究人员发现pHluorin-CD63很难在细胞中稳定表达,这限制了其用于实时成像以选择条件。

在这项研究中,研究人员通过掺入单氨基酸突变M153R改善了superecliptic pHluorin-CD63的稳定性和亮度,该突变先前已确定在细菌蛋白培养中帮助维持pHluorin比例的稳定。研究人员证明了突变的pHluorin-CD63,即pHluo_M153R-CD63,可以在细胞中表达为稳定的构建体,并且是外泌体分泌的信号分子。使用该构建体,研究人员能够轻松地可视化细胞外和细胞内囊泡,并观察细胞在2D和3D培养中沿着细胞外沉积的囊泡路径的迁移,即细胞的寻路行为。通过将其他对pH不敏感的红色荧光蛋白标记pHluo_M153R-CD63,研究人员还能够追踪外泌体生命周期的多个方面,包括融合前细胞内的MVB运动、胞外外泌体的摄入作用以及包含外泌体的内体酸化。

                           

图:双重表达pHluo-M153R-CD63(绿色)和mCherry-CaaX(红色)的HT1080细胞的2D、3D培养实时图像。

参考文献:Sung BH, von Lersner A, GuerreroJ, Krystofiak ES, Inman D, PelletierR, Zijlstra A, Ponik SM, Alissa M. Weaver AM. (2020) A live cell reporter ofexosome secretion and uptake reveals pathfinding behavior of migrating cells.Nat Commun 11(2092).



回复

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

关闭

站长推荐上一条 /1 下一条

QQ|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles   

GMT+8, 2020-5-28 09:14 , Processed in 0.214937 second(s), 9 queries , File On.

Powered by Discuz! X3.3

© 2001-2017 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表