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新型增强光散射灵敏度流式细胞仪用于生物纳米颗粒的分析

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发表于 2019-11-19 22:49:40 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 Johnny 于 2019-11-19 22:49 编辑

一种新型增强光散射灵敏度的流式细胞仪用于生物纳米颗粒的分析
细胞外囊泡(EVs),大小在30-1000 nm之间,由体内的活细胞大量产生,并参与正常生理和病理过程。EVs存在于所有体液中,具有作为癌症、心血管疾病等疾病的生物标记物的潜力。但是,由于EVs的尺寸小,很难通过传统技术对其进行净化和分析。

从血液和其他体液中纯化EV的最常用技术是超速离心、尺寸排阻色谱法和PEG沉淀法。这些方法基于EVs的密度、大小、表面电荷或其他特性,这几种方法对特定的小颗粒种群有倾向性,并且每种方法都会有不同程度的残留蛋白和脂蛋白污染水平。此外,所得样品的实验表征通常需要多种方法,包括蛋白质印迹、基于珠子的夹心测定、基因组测定、动态光散射(DLS)和纳米颗粒跟踪分析。尽管这些方法可以提供有关EVs生物学的特征,但它们最终会掩盖单个颗粒的特征,从而无法正确地分析EVs种群和亚群。相比之下,流式细胞术是悬浮液样品中单颗粒分析的方法,可能特别适合解决EV领域的需求。

流式细胞仪可以对EVs和其他生物颗粒(包括病毒和细菌)进行定量、多参数表征。但是,EVs和其他生物纳米颗粒通常落在常规流式细胞仪的背景噪声之内,这限制了它们对分析此类样品的可用性。实际上,最灵敏的常规流式细胞仪已被认为无法检测到直径小于300纳米的EVs。由于微泡大小的范围实际上延伸至150 nm,而外泌体的直径在30–150 nm之间,因此这导致了一个共同的认知,即流式细胞仪只能检测到EVs的冰山一角。

为了提高传统流式细胞仪的灵敏度,该研究开发了一种基于半导体的流式细胞仪,称为CytoFLEX,该器件将硅雪崩光电二极管(APD)与波分复用(WDM)结合,优化的流通池设计和二极管激光器配对为了最大化信号和最小化噪声。硅APD是半导体光电探测器,与传统的光电倍增管相比,它具有更高的量子效率和更低的电子噪声,从而在更大的波长范围内提高了光检测灵敏度。WDM设计采用电信行业的光纤技术,消除了传统上用于将光分成滤色树内的色带的二向色镜,从而防止了典型流式细胞仪中出现的到达带通滤波器之前20-50%以上的信号损失(图A)。CytoFLEX流通池经过专门设计,可使用类似于天文望远镜中发现的折反射光学功能最大程度地捕获光,收集大约110°的侧向散射和荧光,同时还减少了通常来自替代激光源的由光的交叉混合产生的光学噪声(图B)。总的来说,这些创新可以使用低功率二极管激光器和小面积APD,从而进一步降低了电子和热噪声。结果,CytoFLEX上的光散射检测性能灵敏,蓝色的侧向散射(SSC,488 nm)通道实际上需要衰减滤波器以将信号减小到对细胞和其他大颗粒有用的范围。另外,CytoFLEX上的紫色SSC(VSSC,405 nm)未过滤,可充分利用提高的灵敏度进行小颗粒检测。使用VSSC与SSC进行小颗粒检测还有一个别的好处,即由于增加了相对折射率(RI),短波长的光实际上增加了小颗粒散射的光量。

CytoFLEX中的光学创新。(A)波分复用是一种解析光波长范围的方法,它适用于电信行业中使用的光纤技术。来自光缆的输入光被带通滤光片顺序反射,直到特定的波长范围遇到允许该光穿过的相关滤光片。这种设计使分色镜中出现的光损失最小化。(B)折反射流通池设计可最大程度地收集光。平面凹面镜将约110°的侧向散射和荧光聚焦在流通池背面。然后,通过类似于施密特校正板设计的透镜对光路进行整形,该透镜将来自不同激光器的光导引到它们各自的光纤针孔,同时还使光的交叉混合最小化。
为了正式评估CytoFLEX的光散射灵敏度,该报道建立了一系列实验来测试各种合成和生物纳米颗粒的检出限。首先,使用聚苯乙烯(PS)和二氧化硅(Si)尺寸标准的混合物分析了CytoFLEX上不同的光散射检测模式,尺寸范围从81 nm扩展到2 μm。然后,测试了各种小的低散射颗粒,包括合成珠子和病毒,以更好地评估CytoFLEX上VSSC的分辨率极限。接下来,开发了一种新方法,可使用缩放的Mie理论曲线将散射强度测量值转换为大小和/或RI,以便对不同组成的粒子进行更好的表征,甚至可以预测灵敏度极限。使用此方法,确定了多种病毒的RI,然后确定了病毒的精确大小和大小范围

通过流式细胞术确定病毒大小。(A–D)(A)HAdV-5,(B)HIV-1,(C)MLV和(D)HSV-1的VSSC-H统计数据。(E)拟合RI 1.47在405 nm处的VSSC-H强度-大小曲线,以计算病毒大小。(F)(A-D)中每种病毒的计算尺寸特征。
最后,分析了血浆来源的EVs,并将VSSC强度测量结果与动态光散射(DLS)进行了比较,以将中位散射强度与体积测量结果相关联。这些测量结果还用于分析不同尺寸的EVs的RI分布,证实了文献中的先前观察结果,表明EVs的RI随着尺寸的减小而增加。

利用CytoFLEX检测的四次跨膜蛋白在CD61+血浆EVs上的表达

总之,CytoFLEX是一种新型的基于半导体的流式细胞仪,它利用雪崩光电二极管、波分复用、增强型光学器件和二极管激光器来最大程度地捕获光并将光学和电子噪声降至最低。由于对使用胞外囊泡(EVs)作为疾病生物标记物的兴趣日益浓厚,并且越来越需要使用流式细胞仪来分析生物纳米颗粒,因此该研究评估了CytoFLEX对小颗粒检测的光散射敏感性。研究发现CytoFLEX可以通过紫色侧向散射(VSSC)完全解析70 nm的聚苯乙烯和98.6 nm的硅胶珠。进一步分析了包括病毒和EVs在内的生物纳米颗粒的检出限,并表明CytoFLEX可以检测到低至81 nm的病毒和至少小至65 nm的EVs。此外,可以对EV表面抗原进行免疫表型化,包括直接在血液和血浆中进行免疫表型化,证明血小板EVs用CD61和CD9双重标记,以及用CD81三次标记一个供体中的EV亚群。为了评估病毒和EVs的折光率(RI),该研究设计了一种新方法,可使用强度与尺寸数据以及按参考粒子测量缩放的米氏理论散射效率来反算RI。每种测试的病毒在405 nm处具有等效的RI,约为1.47,这表明流式细胞仪可更广泛地用于确定病毒大小。研究还发现,随着粒径减小到150 nm以下,EVs的RI会增加,从200 nm EVs的1.37增加到65 nm EVs的1.61,从而扩大了可以通过光散射检测到的EV的下限。总体而言,这项研究证明了CytoFLEX与常规流式细胞仪相比具有前所未有的灵敏度。因此,CytoFLEX可以极大地促进病毒学和EVs的研究,并通过直接分析患者样本(包括血液、血浆、尿液和支气管肺泡灌洗等)中生物纳米颗粒上的抗原表达,有助于扩大流式细胞术在微创液体活检中的应用。

流式细胞仪的折射率
纳米级流式细胞仪通常用于分析EVs样品。检测来自染色样品的荧光以及前向和侧面光散射,以收集可用于区分颗粒的数据。散射测量取决于几个变量,包括样品和流式细胞仪中悬浮介质(鞘液)的折射率。
折射率(RI)影响介质的光散射能力。折射(即光的弯曲)发生在光束从一种介质(例如流式细胞仪中的鞘液)穿过另一种折射率不同的介质(例如细胞或EV)时发生。当光在介质之间的界面处弯曲时,它可能与流式细胞仪中的光散射检测器相互作用。通过两种具有相似RI的介质的光不会发生很大的弯曲,而与初始介质相比,随着材料RI的增加,光的折射也会更大。

参考文献:
Brittain GC 4th, Chen YQ, Martinez E, Tang VA, Renner TM, Langlois MA, Gulnik S. A Novel Semiconductor-Based Flow Cytometer with Enhanced Light-Scatter Sensitivity for the Analysis of Biological Nanoparticles. Sci Rep. 2019 Nov 5;9(1):16039. doi: 10.1038/s41598-019-52366-4.



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