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普通超速离心和密度梯度超速离心的EVs蛋白质组学表征

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发表于 2019-4-25 22:03:36 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 Johnny 于 2019-4-25 22:03 编辑

胞外囊泡蛋白质组学表征——普通超速离心和密度梯度超速离心之间的比较

细胞外囊泡(EVs)被发现之后的很长一段时间里一直被认为是细胞释放废物的垃圾桶,但是现在它们已引起了全世界的兴趣。EVs是脂质双层膜囊泡,直径范围在30到1000 nm之间,被认为是细胞-细胞通讯的关键信使。人们正在研究它们以生理或病理方式转移信息从而影响受体细胞功能的能力。EVs涉及多个学科,包括神经生物学、免疫学、肿瘤学和纳米技术。它们也因其作为生物标志物的潜在用途而引起临床兴趣。它们的内容物通常称之为“货物”,具有多种生物活性。实际上,EVs携带蛋白脂质核酸。EVs是高度异质的,大小不一细胞内起源也不同,所以在过去几十年中,人们试图使用这些标准对它们进行分类。因此,出现了两个主要的EVs群体:exosomes和ectosomes。Exosomes,外泌体,直径为30-100 nm,在内体系统内产生为腔内囊泡,并通过多泡体与细胞膜融合而分泌。相比之下,ectosomes,也称为微泡(microvesicles),直径为50 nm至1000 nm,是细胞膜向外出芽形成的。尽管它们在大小和起源方面存在差异,但这两种EVs群体存在共同的标记,到目前为止还不可能完全区分它们。

中枢神经系统(CNS)是一种复杂的“机器”,其细胞间通讯对维持体内平衡至关重要。胶质细胞参与多种CNS功能,包括发育和神经元维持。最近的报道表明,EVs在这种神经胶质-神经元串扰中起着至关重要的作用。

在神经胶质细胞中,小胶质细胞被认为是CNS的常驻免疫细胞。它们是涉及多种功能的多任务细胞,具有神经保护作用和神经毒性作用。多年前在不同的原口动物,如软体动物、节肢动物和环节动物中,描述了发挥类似功能的小胶质细胞的存在。

一些研究报道过小胶质细胞分泌EVs。它们的蛋白质成分包括酶、分子伴侣、四次跨膜蛋白和膜受体等。在ATP刺激后,小胶质细胞释放携带IL-1β和IL-1β加工酶caspase-1的EVs。小胶质细胞在干扰素γ处理后被证实其分泌的EVs含有MHC-II类抗原。综合这些研究表明,不同的刺激可使小胶质细胞产生不同成分和功能的EVs

医用水蛭(Hirudo medicinalis)是神经科学中众所周知的动物模型,因为它能够在损伤后自然再生CNS,并且是研究小胶质细胞参与再生机制的有价值的模型。其中枢神经系统呈现围绕神经节神经元的大型小胶质细胞群及其在结缔组织中的轴突延伸。这些细胞表达与哺乳动物相似的免疫标记物。有趣的是,这种无脊椎动物模型没有星形胶质细胞或少突胶质细胞。
以前的研究表明,受伤后,小胶质细胞被募集到病变部位,这表明这些细胞在修复机制中具有重要的意义。这种募集与大量EVs的分泌相关,最近通过免疫组织化学得到证明。在体外,这些囊泡迅速粘附在神经元体和生长神经突的表面,表明它们在生长过程中起作用。

来自法国的研究组在近期的JEV杂志上发表文章,通过普通超速离心和密度梯度超速离心2种方法分离和表征了由水蛭小胶质细胞的原代培养物释放的EVs。通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)方法测量颗粒的量和尺寸。使用透射电子显微镜(TEM)研究它们的形态。通过差速超速离心(UC)纯化EVs,然后通过另外的Optiprep密度梯度(ODG)离心步骤纯化EVs。用这两种方法纯化的囊泡进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)以解析它们的蛋白质组学。通过结合所有这些方法,建立一种有效的策略,从实验模型中分离小胶质细胞囊泡。该研究分析了密度梯度中所有的组分,而不仅仅是预期含有EVs的那些组分。此外,这项工作为无脊椎动物模型中小胶质细胞释放的囊泡带来了新的见解,证实了哺乳动物EVs的保守蛋白质特征的存在。

细胞外囊泡(EVs)收集和分离策略。(a)解剖水蛭CNS并进行机械解离。通过过滤将小胶质细胞与神经元分离并进行原代培养。(b)通过连续的离心步骤从条件培养基中除去小神经胶质细胞和凋亡小体。通过差速超速离心从条件培养基中分离EVs(UC样品)或进行进一步的密度梯度超速离心步骤。(c)在Optiprep密度梯度分离后,收集EVs。

EVs的透射电子显微镜。(a)Optiprep密度梯度分离EVs的形态学。(b)通过简单的超速离心纯化的EVs显得扁平化。在背景中注意到一层球状脂质(箭头)。(c)观察EVs聚集物,与所用的分离方案无关。

EVs的GO分析,对UC和ODG样品进行比较

ODG纯化EVs的神经营养活性体外测定

参考文献:
T Arab, A Raffo-Romero, C Van Camp, Q Lemaire, F Le Marrec-Croq, F Drago, S Aboulouard, C Slomianny, A-S Lacoste, I Guigon, H Touzet, M Salzet, I Fournier, C Lefebvre, J Vizioli & P-E Sautière (2019) Proteomic characterisation of leech microglia extracellular vesicles (EVs): comparison between differential ultracentrifugation and Optiprep™ density gradient isolation, Journal of Extracellular Vesicles, 8:1, 1603048, DOI: 10.1080/20013078.2019.1603048
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