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如何利用96孔板定量细胞外囊泡且不受杂蛋白影响?

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发表于 2019-2-12 15:22:20 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 Johnny 于 2019-2-12 13:02 编辑

如何利用96孔板定量细胞外囊泡且不受杂蛋白影响?

细胞外囊泡(EVs)领域是生物医学科学中呈成指数增长的细分领域。由于EV在各种生物过程中的重要作用以及它们作为疾病的生物标志物的潜力,细胞外囊泡(EV)领域在生物医学中引起了极大的关注。然而,EV样品的归一化和量化问题尚未完全解决。目前,EV样品基于其蛋白质含量和纳米颗粒的数量进行标准化然而,即使这种组合方法(蛋白含量+颗粒数量)也可能导致EV浓度的不准确和过高估计。脂质双分子层是EV不可或缺的组成部分。因此,基于脂质的定量与颗粒计数和/或蛋白质含量相结合,似乎是EV领域的直接且合乎逻辑的方法。

主要问题之一是富含EV的样品的污染物(例如蛋白质聚集体和脂蛋白)可与EV共享生物物理参数。粒子计数方法无法区分囊泡和非囊泡结构。通常用于EV标准化的方法依赖于用比色反应(例如MicroBCA)测量总蛋白质含量。重要的是,根据定义,EV被磷脂双层包围;因此,脂类(如磷脂和胆固醇)是所有EV的重要组成部分。理想情况下,脂质检测有助于区分蛋白质聚集体和EV。然而,EV和脂蛋白之间的区别仍然具有挑战性。基于脂质含量的EV样品的定量和标准化以及基于蛋白质与脂质比率的EV纯度的估计由于缺乏合适的方法一直未得到开发。

最新发表在JEV上的一篇报道改进了先前报道的磺基-磷酸-香草醛(Sulfo-phospho-Vanillin,SPV)脂质测定方法用于定量细胞外囊泡。该方法引入了水相脂质体标准品(DOPC)来代替有机溶剂中纯化的脂质标准品(在以前的研究中常用)。此外,研究人员优化了测定中香草醛试剂的浓度。研究发现从反应混合物中消除有机溶剂可以消除干扰测定的背景颜色。优化的测定与商业脂质试剂盒的相比(基于最初的SPV脂质测定),灵敏度增加约一个数量级。总之,该研究报告了一个快速、可靠和灵敏的测试,可以填补EV标准化的现有差距。当使用此处报道的优化脂质测定时,EV脂质测量可以比基于蛋白质的测量更可靠。此外,这种新型测定几乎与使用简单BCA测试测量蛋白质一样灵敏和容易。

测定方法如下(详细信息请参考原文):
将体积为200μL的96%硫酸添加至40μL脂质体标准品或40μL EV的PBS悬液中或1.5 mL试管中的去离子水或NaClHEPES缓冲液中。发现试管的塑料组合物和可能的涂层或壁组分对于试验的成功是关键的。研究发现一些试管可能含有可能与试验成分相互作用的表面涂层,并可能引起假象。

在短暂涡旋后,将试管在通风橱中90℃温育20分钟。通过将管在4℃下放置至少5分钟将管冷却至室温,并向每个管中加入120μL磷酸-香草醛试剂并涡旋。接下来,将280μL的每种样品转移到96孔板中,并使显色反应在37℃下显影1小时。用平板读数器测定540nm处的吸光度。

通过引入水相DOPC脂质体标准代替如前所述溶解在有机溶剂中的纯化脂质,并通过使用优化的磷酸-香草醛试剂浓度来增加先前测定的灵敏度。该脂质测试的灵敏度接近于常用的蛋白质Micro BCA测定法的灵敏度。具有20%RSD的测定的定量极限是约0.5μg脂质,具有0.2 μg检测限,这使得该测定适合于EV样品的常规标准化。如果制剂足够纯,则具有约0.5-1μg蛋白质含量的EV样品足以用于脂质测定。将脂质测定与比色蛋白质测量(例如Micro BCA)相结合,可以快速且容易地测试EV样品的质量。该测定不受核酸和蛋白质的影响;但是,样品缓冲液不应被可被硫酸严重氧化的分子严重污染​​。此外,残留的碘克沙醇通过其苄基环可以增加测定的背景。值得注意的是,干扰脂质测定的分子(例如糖)也可能干扰蛋白质比色测定。塑料制品的质量和试剂的纯度也是必不可少的。

然而,由于该脂质测定法无法区分膜脂质和脂蛋白,因此血浆中EV样品的标准化仍然具有挑战性。

基于香草醛的SPV测定法测量不饱和脂质。不饱和脂质的mol%可以在不同的EV制剂之间变化。此外,对于特定细胞类型、生物膜的分布不是恒定的,并且不饱和脂质的mol%取决于营养和培养条件。然而,如果不饱和度以mmol不饱和碳键/g脂质表示(这是通过SPV测定法测量的关键参数),则不同哺乳动物脂质膜样品之间的变化似乎消失。重要的是,与质膜相比,sEV的膜含有大约两倍的胆固醇。值得注意的是,胆固醇具有2.58 mmol不饱和碳键/g脂质,其高于质膜的平均碳键/g脂质。因此,sEV膜中胆固醇浓度的增加可以补偿sEV中饱和磷脂水平的增加。因此,质膜和sEV膜之间的差异可能因胆固醇水平升高而消失(如果饱和度以mmol不饱和碳键/g脂质表示,则通过SPV测定检测参数)。在DOPC脂质体用作标准品的情况下,不饱和度水平接近生物膜的不饱和度水平。

该方法可以在任何标准实验室中使用,其中有通风橱、热电偶和分光光度计。它不需要昂贵的设备,并且没有脂质荧光染料可能形成的聚集体。尽管存在局限性(仅测量不饱和碳键且不能区分脂质和脂蛋白),优化的测定法是EV量化和EV实验标准化的简单、可靠和快速的方法。即使SPV测定法不能作为EV标准化的单独独立技术,它可能与蛋白质或颗粒测量结合起来非常有用,并且它可以为EV标准化提供新的基本工具。

参考文献:
Visnovitz T, Osteikoetxea X, Sódar BW, Mihály J, Lőrincz P, Vukman KV, Tóth EÁ, Koncz A, Székács I, Horváth R, Varga Z, Buzás EI.An improved 96 well plate format lipid quantification assay for standardisationof experiments with extracellular vesicles. J Extracell Vesicles.2019 Jan 29;8(1):1565263. doi: 10.1080/20013078.2019.1565263. eCollection 2019.
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