感觉电镜做废了

hzangs

铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量过高，干燥过程中蛋白张力拉扯铜网破裂的。 也就是说样品中杂蛋白太多了。
第一张的黑团子尺寸是对的，但形态不对，边缘不光滑，有可能是高聚物结晶或者是其他颗粒。第二章的那一个如果按照下方标注的比例尺估算大概在60nm 直径，形态上看上去可能是,但是 孤木不成林，我不敢说它就是或者就不是 。 剩下的图片里  都不是外泌体。

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 14:55
谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片 ...

我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的试剂盒，还不如自己配PEG  便宜又好用

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离我尝试过。电镜分析 直径300-400nm的microvesicles挺多。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离的商业化我尝试过，电镜分析 直径300-400nm的microvesicles太多，不能够拿到外泌体组分，只能拿到囊泡组分，你可以考虑自己更换柱材，选择更好 的柱材自己制作排阻柱进行分离，有相关的paper你可以自己查一查。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。不同的计数方法有些偏向于检测的粒子确定是外泌体，有些检测方法偏向于检测粒子数目的准确性，关于最后一个问题，你要自己去查看paper，目前没有太好的外泌体计数方法，很难兼顾特异性和准确性。

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-15 17:28
还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？
...

粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。但是如果可以结合NTA或者流式荧光标记囊泡再检测数目  这个比值的意义可能会更好一些。

hzangs

pytruth 发表于 2016-7-18 09:36
好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？ ...

你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的