感觉电镜做废了

pytruth

小弟刚开始做细胞上清外泌体，最近老板跟锐博挺熟的，让试试锐博的exosome提取试剂，我用9ml细胞培液提出来exosome，肉眼不可见，用的40ulPBS重悬，但测了蛋白浓度能到2ug/ul，NTA检测峰值在190多，不知道正常吗？电镜制样采取牛人hzangs的方法，请一个师兄帮我染的，吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟上机，
镜下发现铜网的膜破了，几乎就没找到像样的外泌体，不知道是不是因为浓度太高了？电镜图见下，请各位牛人帮小弟看看都是什么东西？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 10:14
铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量 ...

谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 15:08
我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的 ...

好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个外泌体？
2.hzangs用过IZON的qEV吗？外泌体得率是不是要比高速离心法低？
3.现在用什么方法提取外泌体能兼顾得率和外泌体质量？
4.如果用超速离心或者qEV等方法会破坏外泌体的膜结构吗？
5.假如我要了解两组不同处理的同种细胞外泌体分泌的差异，现在有什么方法能够对比哪种处理使细胞分泌的外泌体增加或减少？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要 ...

好的，非常感谢！能多问一下，能否把您细胞上清超速离心的操作流程提供一下参考一下吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高， ...

还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-16 20:00
粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。 ...

好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？

pytruth

hzangs 发表于 2016-7-18 09:55
你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的

好的，谢谢！