关于质谱exosome or EVs的marker

子非鱼

seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么方法清洗？是超离之后大量PBS超离清洗？那对于试剂盒提取的外泌体可以用PBS重悬后二次沉淀吗，或者甚至三次沉淀......
2.对于血清外泌体打质谱，如何做到外泌体的清洗呢？
PS：实验室里无超离设备。期待您的回复！

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-3 09:19
很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般 ...

谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！但是细胞培液提取的exo，得到的蛋白比对ExoCarta等数据库，总体还不错。看到您的帖子，知道您擅长LC-MS这块，所以还想请教：SBI提取250ul血清的exo，kit沉淀要加大剂量PBS清洗然后再沉淀吗？二次沉淀时候加多少PBS？（最近的一片报道说PEG6000可以大量且经济的配制类似于kit的提取液，所以已购买PEG6000，决定拿这个来提取血清exo，并进行二次沉淀，就是不清楚要加多少量PBS二次沉淀来去除那些高丰度蛋白。。。有点啰嗦）
另外，因为也要做RNA深度测序，不知您涉及过吗，我提了2次RNA，总量在250ng左右，全部用来电泳，均没有见到条带。想请问一下问题出在那里，是总血清量少，还是冻存的exo的时候必需加trizo，不加就降解完了？期待您的回复！

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-5 14:07
我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁 ...

很详细，很感谢！！！我提取细胞外泌体就按这个protocol了（看到“过夜“俩字，直觉是细胞配液的提取方法）；
另外，您提取过血清exosome吗？洗涤用多少PBS？

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-5 16:33
血清其实就是将培养液浓缩10倍的东东，差不多，由于血清量一般比较少，所以清洗次数差不多就行，量最好不 ...

太好啦~~祝贺您！！之前还在想跟您要paper之类的...可以把您的paper发过来或者paper链接也行，我想学习学习！我邮箱：jokololo@163.com
Ps：血清exo用SBI提取后就是淡黄色的，所以铁定是不纯的了，多谢您的指点！！

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

大神啊~~那文章出版了别忘记发给我；我先分析我的数据，有问题还真得向您请教！

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-5 16:51
不用客气，大家共同提高，文章才刚刚接收，还没出来呢，等出版了再发给你哈。有蛋白组学、质谱方面的问题 ...

请问，有没有什么软件可将蛋白gi号批量转换为GeneID和gene symbol的？