讨论：血清外泌体提取后杂marker条带-背景高

子非鱼

    RT：鄙人用SBI ExoQuick提取血清中的外泌体，试了4次终于跑出条带了：CD63、CD9、Flotillin1都砸出来了，虽然条带不美观（窃以为为血清中油脂去除不彻底）还需优化条件。在此，有点小建议给做血清的小盆友，一定要按照protocol来，我的经验告诉我，SBI盒子做的千万别自行提高蛋白浓度跑电泳杂条带，因为会神马都没有，还有乌云罩顶的背景（大概油脂太多）。    在此，也希望做过血清外泌体的大神们给点建议：如何在血清提取外泌体前去除肉眼看不到的油脂，一个朋友建议将血清拿来再13000g离心15-30min，可是SBI试剂盒要求3000g离心30min即可，所以有点迷惑，加大离心力会对血清中的外泌体提取前有影响不？
    PS：上几张图：大家帮我分析下，黑黑的一团一团的东西是什么原因，是油脂吗？
    PPS:CD63砸到两条条带：25kDa和50kDa处
新鲜western出炉咯~~（Ppps：私心作怪，好图留用，把最不清楚的图放上了，希望大家谅解！另外：还需更正一个问题，起初上的条带中：Flotillin1是上面最浓浓一团那个，不是下面细细的那些，今天把膜和相片好好比对了一番确认的，如有误导向大家道歉了！）
   说一下此次的条件：仍然250μl血清按比例+试剂（A：0.22μm微孔膜过滤），提取exosome后的血清，查网上帖子说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处由于稀释液准备不够，只进行了4倍的稀释（RIPA稀释），+5Xloading buffer，每个well上样6μl，然后120V浓缩胶，200V分离胶，250mA恒流湿转，5%脱脂牛奶封闭4摄氏度overnight，次日一抗孵育RT，3h；TBST洗：10minX3次；二抗孵育RT，1h；TBST洗：10minX3次；发光液加，成像仪显像，over！

子非鱼

另外，红线划到的地方为目的条带

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-14 12:20
看着挺不错的结果~~
有一个问题~
有没有看一下， 单杂血清  或者去掉exosome的血清  有没有这些条带？

     斑竹，还没看呢，之前看到帖子说血清蛋白复杂，westernt不好做，我就先没做，而且只上exosome，都这么多油脂.......
    这次我优化下条件再做一次，顺带把提exosome后的血清也跑一次，再跟斑竹汇报吧~

子非鱼

xinyi717 发表于 2016-1-14 22:53
还有想问一下试剂盒中有提到用500微升血清，但感觉不同病人血清也会不同，可能内含外泌体的量也不同，不知 ...

亲，小楼也是刚开始做，提了4个血清样本，肉眼看都差不多的沉淀，外泌体的浓度还没有测过，因为好麻烦的说，每次都要制作标准曲线，今晚会测一次。个人以为：病人不同所含外泌体就不尽相同，应该所有样本都定量提取，是多少都是多少，个人建议，请谨慎参考^_^

子非鱼

wooway 发表于 2016-1-15 09:03
楼主是用多少血清提的外泌体，然后提的蛋白？你的上样量大概是多少？我也是做血清外泌体，最近准备补WB ...

    先回答你问题：250μl血清配比试剂，提取外泌体后，200μlRIPA裂解，上样10μl
    PS：哎，这里允许小楼少许啰嗦，给各位提个醒，估计没人会犯我这种错误：小楼刚开始用2个500μl血清配比试剂分别提取的外泌体，怕量少再没有任何根据的情况下，盐水稀释后，一份仅加了200μl盐水+loding buffer、一份仅加了200μl的RIPA裂解+loading buffer（此处：注意量），最后沸水煮5min，western上样10、20μl的都有，结果神马都没跑出来，跑了三次还是神马都没有，最后分析到可能是样本浓度过高，后来重新提了一次，这回老老实实找出protocol，踏踏实实按步骤来，即：250μl血清配比试剂，提取外泌体后，200μlRIPA裂解，上样10μl（适当调低，因为我的CD63条带好浓的说~），终于跑出了以上不甚美观的结果。当然这里各个步骤设了好多质控，才发现
    最后祝你出个漂亮条带！

子非鱼

wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝！我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

裂解之后没再离心了直接加loading了，你可以试试离心，我用的裂解液是实验室技术员配制的RIPA，具体成分品牌我现在不清楚.......还有你的考马斯在哪里？我么有看到

子非鱼

wooway 发表于 2016-1-15 14:16
我用的是LIFe的试剂盒目前还没有做过标志蛋白只是做了一个考马斯亮蓝！我还想问下楼主你用裂解液裂解完之后 ...

补充一句：我用的和裂解细胞的一样，据说有童鞋没加裂解液也可以做出来，我之前设了这个对照，但因为上样量的原因，结果不好，但是应该是可行的，感觉裂解液有作用，但没辣么大，感觉“加不加裂解液”不是”有或无“的结果，wooway可以试试，祝成功~

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

斑竹，昨晚刚出锅的条带，有空来看~

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-14 13:32
我也想看看   去掉 exosomes的血清里  会不会有这些游离的marker   谢谢你啦~

提取exosome后的血清，查网上帖子血清浓度太高，约有说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处由于稀释液准备不够，只进行了4倍的稀释（RIPA稀释），+5Xloading buffer，每个well上样6μl。

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-16 11:53
也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的？

说实话，是不是一致我不确定，样品我都分出来一些，晚上统一测浓度看看~