讨论：血清外泌体提取后杂marker条带-背景高

子非鱼

    RT：鄙人用SBI ExoQuick提取血清中的外泌体，试了4次终于跑出条带了：CD63、CD9、Flotillin1都砸出来了，虽然条带不美观（窃以为为血清中油脂去除不彻底）还需优化条件。在此，有点小建议给做血清的小盆友，一定要按照protocol来，我的经验告诉我，SBI盒子做的千万别自行提高蛋白浓度跑电泳杂条带，因为会神马都没有，还有乌云罩顶的背景（大概油脂太多）。    在此，也希望做过血清外泌体的大神们给点建议：如何在血清提取外泌体前去除肉眼看不到的油脂，一个朋友建议将血清拿来再13000g离心15-30min，可是SBI试剂盒要求3000g离心30min即可，所以有点迷惑，加大离心力会对血清中的外泌体提取前有影响不？
    PS：上几张图：大家帮我分析下，黑黑的一团一团的东西是什么原因，是油脂吗？
    PPS:CD63砸到两条条带：25kDa和50kDa处
新鲜western出炉咯~~（Ppps：私心作怪，好图留用，把最不清楚的图放上了，希望大家谅解！另外：还需更正一个问题，起初上的条带中：Flotillin1是上面最浓浓一团那个，不是下面细细的那些，今天把膜和相片好好比对了一番确认的，如有误导向大家道歉了！）
   说一下此次的条件：仍然250μl血清按比例+试剂（A：0.22μm微孔膜过滤），提取exosome后的血清，查网上帖子说60-80μg的蛋白浓度，需稀释至少10倍再上样，此处由于稀释液准备不够，只进行了4倍的稀释（RIPA稀释），+5Xloading buffer，每个well上样6μl，然后120V浓缩胶，200V分离胶，250mA恒流湿转，5%脱脂牛奶封闭4摄氏度overnight，次日一抗孵育RT，3h；TBST洗：10minX3次；二抗孵育RT，1h；TBST洗：10minX3次；发光液加，成像仪显像，over！

1992caoyan

你好，我想问问，我用的SBI血清外泌体提取试剂盒，用250微升血清样本提外泌体，提取的外泌体有一颗绿豆大小的黄色沉淀，这是杂蛋白吗，用1ml TRIZOL也溶解不了，我不是做外泌体中蛋白检测，是用外泌体来提取RNA吗，有什么办法可以把杂蛋白去除？

子非鱼

ronaldchen 发表于 2018-1-12 14:58
请问楼主用的cd63抗体的货号，谢谢

Abcam买的 去查吧

ronaldchen

请问楼主用的cd63抗体的货号，谢谢

JKF

楼主，我想请教一下，第一孔的是用0.22μm过滤之后的，过滤是在收集沉淀之后过滤离心还是提取之前离心？

子非鱼

hengheng37 发表于 2016-6-16 20:08
楼主你做了电镜吗，我也是用SBI提的血浆，电镜结果背景很杂，而且也没看到典型的外泌体形态，不知道你是什 ...

做了，有两张像，wester也做了，但是后期再补做一下

hengheng37

楼主你做了电镜吗，我也是用SBI提的血浆，电镜结果背景很杂，而且也没看到典型的外泌体形态，不知道你是什么情况

hzangs

子非鱼 发表于 2016-1-18 15:57
已鉴定，总蛋白浓度，血清浓度70μg/μl，对应外泌体浓度是17μg/μl，约4倍的关系。 ...

谢谢你的数据 ~~   这样就解决了一个很大的问题呢

子非鱼

子非鱼 发表于 2016-1-16 15:02
说实话，是不是一致我不确定，样品我都分出来一些，晚上统一测浓度看看~ ...

已鉴定，总蛋白浓度，血清浓度70μg/μl，对应外泌体浓度是17μg/μl，约4倍的关系。

子非鱼

hzangs 发表于 2016-1-16 11:53
也就是说   你exosome样品和 去除exosome的serum 上样的蛋白量是一致的？

说实话，是不是一致我不确定，样品我都分出来一些，晚上统一测浓度看看~