大家关于试剂盒的几点疑问和澄清

Izon

也比较赞同这篇文章中提出的 “粒子浓度/微克蛋白”表示exosome浓度的方法 "Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma" 【http://www.journalofextracellula ... /article/view/27031】，这种结果更真实准确的反应了exosome在样品中的含量。

其实exosome的准确定量不单对区分各种分离方法的优劣有意义，对今后不管在diagnostic还是 therapy的应用领域都是很重要的数据。国外在定量方面的研究和应用已近开展了好几年了，国内也有课题组开始重视这个问题，并开始这方面的研究，比如说在therapy中比较不同量的exosome是否产生不同的效果，以及最佳的效果量等。

evomicscience

多谢两位精彩的体会。peg几十年前就用于沉淀病毒颗粒，极易共沉淀疏水蛋白和脂类小颗粒，如LDL等。SBI最早用它浓缩exosome，确实推进了本学科的发展。由于问题多多，如收率和纯度，是时候重新考虑慎用它抽提exosome，特别是发文章用。考虑到收率，可以外加高度纯化的标记的exosome 到你要抽提的溶液中 spike_in 的方法，看最后恢复多少exosome. 分离纯化是讲收率和纯度。exosome的纯化应结合它的密度和大小。SEC 是目前最优的方法。

yy8651

看到争鸣才最有用，这才是讨论。
感觉两位都有道理
但是有个问题
超离确实费时间又费钱，特别是用含血清培养基的时候，去exosome步骤会浪费一部分血清，超离上机又要耗费大量的培液，这个时间成本和劳动成本都巨高
所以我赞同楼上关于如果做核酸分析试剂盒还是可以的，也赞同功能实验还是应该超离
但是做蛋白分析，我感觉还是超离吧，最好能密度梯度，因为试剂盒真的可能是杂蛋白比较多

seallin

yy8651 发表于 2015-10-27 10:15
看到争鸣才最有用，这才是讨论。
感觉两位都有道理
但是有个问题

这样才能促进大家认知的提高。诚然，目前的策略不适合做蛋白分析，不过通过优化实验方案，如果能两次沉淀，杂蛋白会大大降低，我的跑胶结果最后显示几乎没有血清蛋白如白蛋白和转铁，而如果仅仅进行一次的话（就是试剂盒protocol的策略）还是有很多血清蛋白残留的。我就是做蛋白大规模鉴定的，按照谱图计数表征蛋白相对含量，白蛋白差不多只能排到38位，说明大部分的血清蛋白都被去除了

惜名

你用SBI提取exo做蛋白质谱的么？
第一次提取重悬后再次加EXO-QUICK重悬么？

seallin

惜名 发表于 2015-10-27 14:03
你用SBI提取exo做蛋白质谱的么？
第一次提取重悬后再次加EXO-QUICK重悬么？

不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合物，再次沉淀，这下就纯很多了

hzangs

seallin 发表于 2015-10-27 17:04
不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合 ...

其实 我还是建议楼主去考察一下   粒子数/蛋白 这个值，  这个反映比较直观，说服力也比较强。

seallin

hzangs 发表于 2015-10-27 18:05
其实 我还是建议楼主去考察一下   粒子数/蛋白 这个值，  这个反映比较直观，说服力也比较强。 ...

如果我是你们一线城市就好了，上次去测NTA都是从东北飞到上海去测的，第三次报销的时候看老师脸都绿了。。谢谢你的建议，我会进一步完善之

hzangs

seallin 发表于 2015-10-27 21:20
如果我是你们一线城市就好了，上次去测NTA都是从东北飞到上海去测的，第三次报销的时候看老师脸都绿了。 ...

你可以联系一下izon 或者 nanosight，已合作的方式，到时候发文章方法里写一下的形式体现合作，也许他们可以免费给你测呢~  邮递样品就可以。  我找izon的qNano测粒子浓度的时候 就是邮递过去的，冰袋加厚泡沫盒就行的~~

惜名

seallin 发表于 2015-10-27 17:04
不过不是用SBI提取的，是自己加聚合物提取的。第一次沉淀后去除上清，加水或PBS重溶，再加一定比例的聚合 ...

OK  我也试试用SBI二次提取~