再次分享Transwell小室在exo研究中的应用

惜名

落叶知秋在本板块分享了Transwell小室的应用，http://www.exosome.com.cn/forum. ... =214&extra=page%3D1
本人在此基础上进行了预实验，得到了较好结果，现分享如下

目的：查看A细胞是否通过分泌exo导致HUVEC（内皮细胞）高表达黏附因子（VCAM-1、ICAM-1等）
背景：A细胞为一种免疫细胞，其可以分泌促炎因子（TNF-α等）导致HUVEC高表达VCAM，但是否也可以分泌exo完成这一作用尚不清楚。
设计：6孔板正常培养HUVEC（贴壁细胞），达到一定密度后，于孔中放入Transwell小室，在小室中培养A细胞（悬浮生长），A细胞培养基加/不加GW4869。共培养8小时后，弃小室中A细胞，收6孔板中HUVEC，提mRNA检测VCAM-1和ICAM-1。
结果：1、和对照相比，A细胞共培养可以导致HUVEC分泌VCAM显著升高；2、加入GW4869后，A细胞共培养导致的VCAM升高较不加GW4869下降，但仍然高于对照组（好绕）。
结论：A细胞可以通过分泌“某些东西”导致HUVEC高表达黏附因子，这个“某些东西”包括exosome。


意义：该步实验能够证明A细胞的确可以通过exo参与HUVEC活动（共培养的方式），然后接下来提取A细胞分泌的exo直接加入培养基干预HUVEC得到一致的结果，然后做通路。整条思路就相对完整了。

惜名

第二种方法存在明显缺陷啊，该方法只能说明：A细胞分泌了“某些东西”至培养基中，“这些东西”可以导致B出现功能变化，但这和exosome有啥关系呢？
所以我觉得如果用第二种方法，也需要加一个GW4869，减少exosome分泌，如果能观察到“加GW4869组”和“不加GW4869组”B细胞的功能差异，则可以认为exosome
参与了这个作用。其实这样一来，和Transwell共培养很接近了。

P.S. 窃以为，大文章做到 GW4869是不能满足的，还需要给CD63加荧光信号，确认GW4869可以减少exosome分泌、并且B细胞摄取的荧光信号减少，才能真的证实exosome的确参与了A与B的功能作用。

惜名

stones 发表于 2016-7-8 15:22
版主你是如何解决两种不同细胞培养基不同的问题的呢？这样看来用A细胞的培养上清来培养B细胞，岂不是更加 ...

A和B的培养基如果可以一样，那自然是最好的了。如果不一样，我觉得也可以试试~

惜名

会飞的盈盈1993 发表于 2016-11-6 13:34
楼主 方便问一下您用的小室的货号吗

忘了。。。就是corning的啦  网上随便一搜就很多  这个材料不稀奇的  很常见的啦