Tranwell小室在外泌体功能研究中的初步应用

落叶知秋

seallin 发表于 2015-5-19 09:46
lz的讲解十分详细，给我们外行的人很直观的帮助。唯一的不足，就是细胞培养液用的是无血清的FBS，这样不能 ...

是的，您说的是完全正确的，使用去外泌体血清的培养基也是应了那句：巧妇难为无米之炊！要获得“去外泌体血清“的方式就是2X完全培养基超速离心过夜，这个对于很多实验室来说是incredible，尤其准备测序样本上，上清需要量比较大，为此不得已才选择无血清培养行饥饿培养。希望大家能提供更加好的方法解决这个问题！

惜名

几个问题请教一下楼主：
1、假设6孔板中的A细胞为悬浮生长，那么就不需要等待贴壁过程喽？可以在A细胞悬液加入6孔板中后立即放入小室了？
2、假设小室中的B细胞不做迁移、侵袭等，只提取蛋白或mRNA检测一些表达，那么还需要铺胶预处理小室么？在这种情况下，怎样、何时将B细胞悬液加入小室呢？
3、以6孔板为例，下孔加多少培养基？上面的小室加多少培养基呢？
4、如果细胞A和细胞B的培养基不一样，而且相差很大（譬如，小室中的B细胞非常娇贵，无法耐受A培养基），怎么办呢？

seallin

lz的讲解十分详细，给我们外行的人很直观的帮助。唯一的不足，就是细胞培养液用的是无血清的FBS，这样不能反映真实状态，这只是饥饿状态下的细胞状态的分泌情形。其实细胞的分泌在有无血清条件下差别还是很大的，Eichelbaum在2012年的Nat. Bio...上提过这一点，它比较了有无血清细胞的分泌状态的差别是很大的，譬如分泌蛋白组就差别巨大。不过并没有比较exosome是否差别巨大。我一直觉得分泌蛋白和exosome是共同促进细胞间相互交流的，如果能同时分析这两个一定意义非凡。

itooth

加油

Damon

绝对好东西，好好研究

惜名

干货！怒抢板凳！落叶的exo-miRNA测序和transwell经验都非常赞，后面的童鞋要做可以少走一些弯路啦~

落叶知秋

这几天我又做了侵袭实验，那我就一道写写吧！
它与迁移实验不同的是需要铺基质胶。在这个过程中如何处理好铺胶过程是一个难点。我用的是BD的基质胶，按照说明书用无血清培养基稀释成冻存液（我自己取的名字），于-20℃冻存，此时的他是处于凝固状态的。具体的铺胶过程我就不多介绍，附件当中都有写到。在这里说几点细节：
1、BD的基质胶在铺胶前几个小时置于4℃解冻，不能置于室温，因为室温下，冻存液会很快凝固。
2、使用过程中我们会将冻存液配成工作液，也就是需要稀释后才能铺胶。随着基质胶浓度的改变，其阻止细胞穿透的能力越强。在这里比较关键的问题是，这个基质胶需要在合适的稀释比例下才能保证凝固和适度的阻止细胞穿透能力（比较拗口）。当以无血清培养基将冻存液稀释3倍时，稀释后的基质胶在室温下很块就凝固，而当10稀释倍时后置于37℃过夜也不会凝固。我做的是肿瘤细胞，将基质胶冻存液稀释6倍后（稀释的过程建议在冰上操作，因为在室温下，冻存液在枪头吸取的过程中就有可能凝固，就是这么夸张），取100ul稀释液铺胶于transwell小室中，37℃培养箱过夜后凝固，于小室中(在基质胶上)接种适量细胞（此时的细胞需要用无血清培养基重悬细胞），在小室下面加500ul含20%FBS的完全培养基，培养适宜时间后染色观察。
3、做transwell实验，虽然一个孔需要30多人民币（康宁的），但还是建议做下预实验，会节省很多时间，一般来说基质胶冻存液稀释倍数为5-8倍，如果你的稀释倍数可以在37℃隔夜凝固，那么就说明稀释倍数适宜。接下来就要考虑接种细胞的浓度，强烈建议接种前进行细胞计数，附件中有说到具体接种浓度，浓度高低决定差异的大小以及实验灵敏度。最后再是看侵袭的时间了。总而言之，漂亮的结果来自于实验条件的反复法摸索，经验教训的及时总结以及硬件设备的齐全（显微镜很重要）。
4、昂贵的小室是可以重复利用的
结晶紫染色拍照后，用冰乙酸洗脱结晶紫（可以测OD值，间接反映染色细胞数目，这张图也是可以放在文章中的），用PBS漂洗几次后晾干，24孔板中滴加胰酶，将小室置于其中，让胰酶消化小室膜下面细胞，时间可以长一点问题不大，PBS漂洗若干次后置于75%酒精过夜。最后就是取出小室在紫外线下“晒干”和“晒干净”。虽然有人反映，这样倒腾一下，空会变大，但是我在镜下看了许久，没有发现空有变大，而且实验过程中也没出现污染等问题。当然，如果属于有钱人的孩子呢，不建议重复利用啊！
以上都是一家之言，初来乍到，接触外泌体更是没多长时间，如表述有失严谨或者错误之处，请诸位批评指教，谢谢！