细胞外囊泡（EVs）由所有已知生物体产生并且对细胞通信和生理学很重要。已经发现血浆、母乳和精液等体液中EVs的形态多样性。然而，从单细胞类型纯化时，尚未对外泌体进行详细的形态学分析。
来自瑞典哥本哈根大学的Jan Lötvall和Johanna L Höög在最新的Journal of Extracellular Vesicles杂志发表文章，通过多种电子显微镜技术分析和定量从人类肥大细胞系HMC-1纯化的外泌体的形态。结果显示外泌体形态的多样性，表明可能存在具有不同和特异功能的外泌体亚群。该研究结果意味着需要一种新的更有效的定义外泌体亚群的方法。研究人员提出了一种分类系统，根据其体型和形状将外泌体分为9个不同的类别。除形状外，在外泌体中也发现了三种其他的形态学特征。
这些研究结果表明，从单个细胞系纯化的外泌体也具有形态多样性，与以前对体液中EVs的观察结果相似。这些知识可以帮助改善实验结果的解释，扩大我们对外泌体生物学功能的常规理解。
细胞多泡小体（MVB）内的膜泡具有形态多样性
为了研究HMC-1细胞系产生的外泌体的形态特征，采用多种电子显微技术。如材料与方法部分所述，HMC-1细胞在高压冷冻、冷冻置换和切片后成像。结果显示，细胞内有多个MVB。MVB含有结构不同的囊泡以及正常的单囊泡。一些MVB包含不同大小的囊泡或填充更多的电子致密成分，或含有高电子密度的结构。
图1.显示培养的HMC-1细胞的多泡体（MVB）和周围生长培养基中细胞外囊泡的切面。（A）白框内是HMC-1细胞内的MVB，黑框内是细胞外囊泡（EV）。黑色箭头指示的是细胞突起。（B–H）更高放大倍数的MVBs。白色箭头指向含有一个或多个较小囊泡的囊泡。纯箭头指向分泌颗粒中的电子密度结构。（I-L）更高放大倍数的EV。
这些研究结果表明，即使在释放到环境中之前，细胞培养基中EV和MVB内囊泡的形态学存在多样性。因此，我们会检测到经典分离程序后外泌体的形态多样性。
HMC-1细胞来的外泌体可被分为9个类别
使用差速超速离心分离外泌体，然后用密度梯度纯化分离的外泌体。使用两种不同的技术对外泌体进行成像：负染和冷冻电镜（cryo-EM）。用负染观察到形状和大小的差异，观察到长的小管样囊泡被许多其他不同直径的圆形囊泡包围。由于冷冻电镜可以观测脂质双层和囊泡内部结构，所以可以检测囊泡结构、膜和腔等多种信息。
图2.从HMC-1纯化的形态多样的外泌体。 (A) Exosomes visualised after negative staining. （A）负染后的外泌体。在这张照片中可以确定至少两种不同类别的囊泡：单囊泡（绿色箭头）和长小管（红色箭头）。（B）九个冷冻电子显微照片的拼图。绿色箭头指向单个囊泡，黄色箭头指向双囊泡，小黑色箭头指向基准金标记。圆形形状是多孔碳网格的碳边缘。（C）所有囊泡的大小分布（n =1724）。括号中的数字表示多少囊泡大于500 nm。（D）每个形态类别的囊泡总数百分比。（E）每个囊泡类别的尺寸分布。
1. 单囊泡（Single vesicle）(n = 1409)
单囊泡是所有统计外泌体的大部分（81.7％）。它们被膜双层包被，圆形。 它们的大小范围为71±58 nm（平均值±SD）。
2. 双囊泡（Double vesicle） (n = 19)
双囊泡是一个较大的囊泡包含一个较小的囊泡，形状为圆形或稍微细长。它们的尺寸大于平均单囊泡（174±101 nm; t检验，p <0.001）。
3. 多膜泡（Triple vesicle or more） (n = 4)
当两个或更多个囊泡被包含在较大的囊泡内时，被分为这一类。它们有不同的组合，具有彼此相同的三个囊泡，或者在同一个大囊泡内部具有两个较小的囊泡。只有四个囊泡被归为该类，最小的65 nm，最大的380 nm。
4. 小双层膜泡（Small double vesicle） (n = 19)
这些囊泡与常规双囊泡不同，因为内部结构比双层薄且不连续，这意味着它们的形状没有形成一个完整的圆形。 它们也显著小于双囊泡，其尺寸范围为54±10nm（t检验，p <0.001）。
5. 椭圆膜泡（Oval vesicle） (n = 151)
椭圆形囊泡具有一个双层膜，类似于单个囊泡，但它们呈细长形状，仅具有两个垂直的对称轴。它们的平均大小为114±86nm。
6. 小管（Small tubule） (n = 50)
这些囊泡的特征为单层和细长的形状，但它们与椭圆形囊泡不同，沿其细长轴，其对称轴线的相对侧上的膜彼此平行，导致这些囊泡具有更多的管状形状。它们的尺寸平均为145±87 nm。
7. 大管（Large tubule） (n = 4)
大管不同于小管，因为它们的大小（废话，囧…）。仅鉴定出四个大管，并且它们都长于700 nm；最长的是1400 nm。
8. 不完整的膜泡（Incomplete vesicle） (n = 15)
这些囊泡显示中断的膜，并且通常被电子致密的成分包围。可能是在样品制备过程中发生破裂。
9. 不规则膜泡（Pleomorphic vesicle） (n = 53)
所有不能归类于上面任何类别的囊泡形状都被称为不规则型。 它们的尺寸大于单囊泡（201±87 nm; t检验，p <0.001）。
除了所有这些类别之外，还观察到由位于几个单、双和三圆囊泡旁边的断膜组成的复杂结构。
在不同类别的囊泡中可以发现三个附加特征
除了它们的形态特征之外，一些囊泡具有独立于它们所属类别的三个特征。每个特征的示例如图5（A-I）所示。
图5.外泌体特征列举（A-I）。表面具涂层的膜泡（coated vesicles）（A-D）、内含纤维的膜泡（filamentous vesicles）（D-F，I）和电子致密囊泡（electron-dense vesicles）（D，G-I）的实例。 浅蓝色箭头指向涂层，棕色箭头指向纤维，灰色箭头指向囊泡内的电子致密区域。（J）呈现每个特征的每个囊泡类别的百分比。（K）具有特征的囊泡尺寸分布。
1. 表面具涂层的膜泡（Coated vesicles）
一些囊泡具有表面突起，从膜突出的电子致密尖峰或膜的一部分。大约3.7％的囊泡显示了这个特征（1724年中有63个），平均大小为221±133 nm。
2. 内含纤维的膜泡（filamentous vesicles）
观察到囊泡的一小部分（0.5％）在其内腔中含有纤维。在具有管状形状的囊泡中，细丝与小管的长度平行排列，但是在圆形囊泡中，细丝可以彼此平行排列或更随机分布。内含纤维的囊泡的大小是非常可变的，因为在单个囊泡以及小和大的管中均发现纤维。四个大管中有两个是具有纤维的。
3. 电子致密囊泡（electron-dense vesicles）
这些囊泡似乎充满了电子致密的成分，与相同尺寸的附近囊泡相比，它们的管腔中的纹理更暗。它们的平均大小（306±141 nm）高于总囊泡计数的平均值（t检验，p <0.001）。
特征不是相互排斥的，因为在一些情况下，囊泡可以呈现多于单一特征。
参考文献：
Zabeo D, Cvjetkovic A, Lässer C, et al. Exosomes purified from a single cell type have diverse morphology[J]. Journal of Extracellular Vesicles, 2017, 6(1): 1329476.
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