外泌体处理细胞

惜名

用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓度。
我个人经验，4ml上清提取的外泌体(DC来源)，用200-400ul PBS重悬，然后用100ul干预一个孔（6孔板，HUVEC），是可以得到阳性结果的。

惜名

ffp1988 发表于 2015-4-18 10:09
您所说的10ug/ml是指？？   外泌体的浓度？  怎么测出来的？

10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为外泌体无法用Nano或电镜测浓度（或粒子数），文献多用蛋白量来间接反应外泌体浓度。
譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。
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这里还有一个问题，10ug/ml的浓度只是相对你的实验体系而言的，因为目前认为不同的提取方法会导致exo纯度不一。例如有人认为kit提取的exo含有杂蛋白，这无疑会增加裂解后测得的蛋白浓度，因此使得不同提取方法之间的“外泌体浓度”没有可比性。
梯度密度离心法得到的exo或许目前认为是最纯的。

惜名

kadak007 发表于 2015-6-25 23:44
请教下，pbs-exo冻存于 --80℃，溶解后还能用来处理细胞吗？效果怎样呢？
谢谢~ ...

可以的，效果和新提的差不多，但是你不能在-80度放太久。
我个人经验，2-4周问题不大的。因为每次提出来量都很少，所以很快就用完了
也有人说可放数月。。。

惜名

kadak007 发表于 2015-6-30 15:42
处理细胞前，exo裂解后BCA测浓度，exo不裂解直接测浓度，这两种做法各有什么讲究吗?  ...

是否需要裂解这个问题我看到论坛里有人讨论过。。。
这个我也搞不清楚，反正我每次都是裂解的，不管是测浓度还是跑western

惜名

kadak007 发表于 2015-6-30 16:35
你好，请教下，做exo处理细胞时，每个孔里加多少细胞合适呢？总共需达到多大体积比较好呢？
譬如，25cm2规 ...

我做HUVEC（人脐静脉内皮细胞）的炎症反应，目测细胞密度50-95%的范围内都可以。
25cm2的瓶子面积为六孔板的2倍多一点，我手头的资料提示25cm2瓶子可以获得5*10^6个细胞，六孔板大约是2.5*10^。这样计算你1个瓶子分2个孔还是比较合适的。
当然，你能先摸一下条件是最好的。

惜名

kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主，完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验 每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的蛋白，供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液，每ul约0.2ug。

惜名

kadak007 发表于 2015-7-3 16:23
惜名版主，用exo处理细胞，你有没有想过用小鼠源的细胞？毕竟后续功能实验时都得用小鼠的；
还是说，如果ex ...

有纠结过啊。。。
但是现实条件所限啊，人源的HUVEC是最常见、也是比较容易获得的。

如果做miRNA，其实人源和小鼠源序列几乎都是一样的
如果做蛋白，或许有点顾虑。
不过anyway，这是没办法的折中了。毕竟不求大paper，只求毕业。。。

P.S. 你要点回复我，我才能看到消息，否则我收不到你的提问。。。

惜名

梦想照进现实 发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读，谢谢！

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章，你仔细去找找，大都能找到一些剂量。

惜名

kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主，请指导下，PBS-exo处理细胞，你一般让它们共同孵育多久呢？按小时算，还是按天算？ ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
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如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用，那么时间应该是很快的，只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达，数小时就可以了。如果做蛋白，那就得16-24小时。
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如果你推测exo是通过里面的miRNA作用，那么时间就得参照转染miRNA的了，例如，我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。