有囊泡相关技术问题请在该贴留言！

hzangs

liulin625 发表于 2020-1-10 12:53
您好，请教下SBI Exoquick TC 试剂盒提取外泌体的相关问题。

小鼠乳腺癌EMT6 cell line，正常培养48小时后 ...

方法和起始量问题都不大。  看不出有什么问题。 请直接咨询相关试剂盒的技术支持人员。分析是否试剂盒自身存在问题。

liulin625

您好，请教下SBI Exoquick TC 试剂盒提取外泌体的相关问题。

小鼠乳腺癌EMT6 cell line，正常培养48小时后换成Exo-free 的10%FBS培养基，培养48-72小时后收集上清，提取外泌体。
1 Collect cell culture medium
2 300g 5min, 2000g 20min
3 Collect the supernatant and pass through 0.22um filter membrane
4 Ultrafiltration tube 100kDa, supernatant 15ml, 4000g 30min, 4 centigrade.
6 Collect the residual liquid on the upper part, about 200ul.
7 Add the Exoquick reagent with the ratio (sample Vs reagent, 5 Vs 1), then inverting or flicking the tube.
8 Incubate overnight, about 16 hours under 4 centigrade
9 Centrifuge 10000g 30min.
10 Collect the pellet and resuspend with PBS.
通常，按网上资料显示，试剂盒提取的外泌体会产生大量沉淀，按此操作后，最终未见沉淀出现，细胞量大概5x107。想请您帮忙分析下原因，不知您是否提取过EMT6细胞系的外泌体，可能是细胞系的原因么，还是实验方案的问题，小鼠的外泌体会和人类的大小存在差别么。谢谢

hzangs

sammyml 发表于 2019-12-3 23:21
请问大大 有没有可以查询肿瘤和正常人外泌体某个蛋白质表达量高低的数据库呀 ...

这样的数据库 目前还不完善。 RNA库相对比较完善。  这几个数据库 供你参考

http://www.exorbase.org/
http://microvesicles.org/index.html
http://www.exocarta.org/
https://exrna.org/

sammyml

请问大大 有没有可以查询肿瘤和正常人外泌体某个蛋白质表达量高低的数据库呀

hollychao

hzangs 发表于 2019-12-3 09:49
1. 用什么裂解，取决于你的实验，RIPA能搞定就 RIPA， 不能  就换。 2.如果你研究的是囊泡内蛋白，那么 蛋 ...

谢谢hzangs大神的回复！跟着大神学习~

hzangs

1. 用什么裂解，取决于你的实验，RIPA能搞定就 RIPA， 不能  就换。 2.如果你研究的是囊泡内蛋白，那么 蛋白酶K  是可以的

hollychao

hzangs大神好！我的实验是比较提出来的外泌体内的蛋白含量差异，用Elisa来做，想请问hzangs大神，
1.在elisa前用什么来裂解外泌体比较好呢？用M-PER还是RIPA加蛋白酶抑制剂呢？我是小白所以不太懂
2.用试剂盒提出来的外泌体肯定会有杂蛋白存在，我怎样确保杂蛋白不会影响后面的elisa结果呢？是不是使用蛋白酶k？
谢谢！

psyerLD

hzangs 发表于 2019-11-19 18:54
是的，

好的！谢谢大神！

18331131398

hzangs 发表于 2019-11-20 09:57
植物方面，我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡，不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文 ...

好的，谢谢老师

hzangs

18331131398 发表于 2019-11-20 09:05
hzang老师您好，我想问一下，我是用植物提取的外泌体，一直没找到鉴定蛋白的marker,只做了电镜和NTA，不知 ...

植物方面，我关注的很少。一般认为  植物方面释放的 只能叫做囊泡，不叫外泌体。 你可以参考一下相关的文章  看看他们怎么鉴定的。  植物蛋白跑WB  比较难， 如果其他论文也没有WB鉴定，你可以考虑不做这个实验。