外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 感觉电镜做废了 [打印本页]

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作者: pytruth    时间: 2016-7-15 00:19
标题: 感觉电镜做废了
小弟刚开始做细胞上清外泌体，最近老板跟锐博挺熟的，让试试锐博的exosome提取试剂，我用9ml细胞培液提出来exosome，肉眼不可见，用的40ulPBS重悬，但测了蛋白浓度能到2ug/ul，NTA检测峰值在190多，不知道正常吗？电镜制样采取牛人hzangs的方法，请一个师兄帮我染的，吸取样品10ul 滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，吸去醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液，常温干燥数分钟上机，
镜下发现铜网的膜破了，几乎就没找到像样的外泌体，不知道是不是因为浓度太高了？电镜图见下，请各位牛人帮小弟看看都是什么东西？

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作者: hzangs    时间: 2016-7-15 10:14


铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量过高，干燥过程中蛋白张力拉扯铜网破裂的。 也就是说样品中杂蛋白太多了。
第一张的黑团子尺寸是对的，但形态不对，边缘不光滑，有可能是高聚物结晶或者是其他颗粒。第二章的那一个如果按照下方标注的比例尺估算大概在60nm 直径，形态上看上去可能是,但是 孤木不成林，我不敢说它就是或者就不是 。 剩下的图片里  都不是外泌体。

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作者: pytruth    时间: 2016-7-15 14:55

hzangs 发表于 2016-7-15 10:14
铜网破裂 这个事情我们也遇到过。请教了电镜室的老师，电镜室的老师明确告诉我们，那是因为样品中蛋白含量 ...

谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片吗？

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作者: hzangs    时间: 2016-7-15 15:08

pytruth 发表于 2016-7-15 14:55
谢谢hzangs大神！还想问一下，如果要是试剂盒提外泌体可以通过用pbs洗或者其他方式来得到较好的电镜图片 ...

我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的试剂盒，还不如自己配PEG  便宜又好用

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作者: pytruth    时间: 2016-7-15 15:33

hzangs 发表于 2016-7-15 15:08
我们曾经有人尝试过 但效果还是不好。  但这个我说不准  你最好自己尝试一下。
个人认为  如果用沉淀法的 ...

好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个外泌体？
2.hzangs用过IZON的qEV吗？外泌体得率是不是要比高速离心法低？
3.现在用什么方法提取外泌体能兼顾得率和外泌体质量？
4.如果用超速离心或者qEV等方法会破坏外泌体的膜结构吗？
5.假如我要了解两组不同处理的同种细胞外泌体分泌的差异，现在有什么方法能够对比哪种处理使细胞分泌的外泌体增加或减少？

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作者: hzangs    时间: 2016-7-15 17:02

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离我尝试过。电镜分析 直径300-400nm的microvesicles挺多。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。

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作者: hzangs    时间: 2016-7-15 17:02

pytruth 发表于 2016-7-15 15:33
好的，谢谢hzangs！还有几个个小问题想问一下：
1.能上文章的电镜图片是不是一定要在一个图片中看到多个 ...

要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要求形态越好。凝胶排阻分离的商业化我尝试过，电镜分析 直径300-400nm的microvesicles太多，不能够拿到外泌体组分，只能拿到囊泡组分，你可以考虑自己更换柱材，选择更好 的柱材自己制作排阻柱进行分离，有相关的paper你可以自己查一查。 现在最好的分离外泌体的方法就是超速离心，这是所有囊泡领域的大牛比较赞同的方法。不同的计数方法有些偏向于检测的粒子确定是外泌体，有些检测方法偏向于检测粒子数目的准确性，关于最后一个问题，你要自己去查看paper，目前没有太好的外泌体计数方法，很难兼顾特异性和准确性。

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作者: kasangzc    时间: 2016-7-15 17:16

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要 ...

你的意思是 qEVD得到的样品直径太大吗？

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作者: pytruth    时间: 2016-7-15 17:27

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高，要 ...

好的，非常感谢！能多问一下，能否把您细胞上清超速离心的操作流程提供一下参考一下吗？

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作者: pytruth    时间: 2016-7-15 17:28

hzangs 发表于 2016-7-15 17:02
要么有一个非常典型外泌体照片，就是那种茶托样的。 要么就是有比较像的。 当然看paper档次，档次越高， ...

还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？

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作者: hzangs    时间: 2016-7-16 20:00

pytruth 发表于 2016-7-15 17:28
还有就是，之前看论坛里有提到用粒子数/蛋白量来比较两组细胞分泌的外泌体多少，这个方法您觉得怎么样？
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粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。但是如果可以结合NTA或者流式荧光标记囊泡再检测数目  这个比值的意义可能会更好一些。

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作者: pytruth    时间: 2016-7-18 09:36

hzangs 发表于 2016-7-16 20:00
粒子数/蛋白量只能反映出样品中 杂蛋白的多少。 这个值也大 说明系统中粒子数目越高。 这个值并不严谨。 ...

好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？

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作者: hzangs    时间: 2016-7-18 09:55

pytruth 发表于 2016-7-18 09:36
好的，谢谢！还请问一下，能把您细胞上清超速离心提取外泌体的操作流程提供一下参考一下吗？ ...

你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的

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作者: 下里巴人    时间: 2016-7-18 17:49
感谢分享！

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作者: pytruth    时间: 2016-7-20 10:47

hzangs 发表于 2016-7-18 09:55
你可以参考  2006年thery 发表的那篇protocol   就是按照那个来的

好的，谢谢！

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作者: yanzi_sjtu    时间: 2017-9-12 09:50
我之前也做过两次铜网破裂，后来稀释了大概三四十倍，就可以了

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作者: sunshow    时间: 2017-9-12 18:10
我提的是血浆的外泌体，也发生同样的事，杂蛋白太多，膜破了。不知道也没有办法先去除高丰度的蛋白质，再提外泌体会不会好一点。

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作者: IPromise    时间: 2017-9-12 21:12
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作者: hunxionfan    时间: 2017-9-19 10:06
铜网上的膜也破了，我的超离血清得到的，等体积重悬了沉淀，10微升滴铜网，发现电镜下也破了，老师建议我稀释

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