外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 求助，从exosome提出RNA后的qPCR. [打印本页]

作者: huan1989111007 时间: 2014-12-30 16:07
标题: 求助，从exosome提出RNA后的qPCR.
求助各位，由于标本有限，从exosome提出的RNA只有10ng左右，想问下你们做逆转录时用的是哪一家的试剂盒？谢谢各位兄弟姐妹！谢谢！

作者: 惜名 时间: 2015-1-2 14:44
你是做miRNA吧？我用天根的逆转录kit，跑出来循环数较高，25-30个吧。扩增曲线蛮好的~据另一个战友讲，QIANGEN的更好一点，进口的，贵。。。

作者: huan1989111007 时间: 2015-1-2 19:07

惜名发表于 2015-1-2 14:44
你是做miRNA吧？我用天根的逆转录kit，跑出来循环数较高，25-30个吧。扩增曲线蛮好的~据另一个战友讲，QIAN ...

thanks. 确实是miRNA. 看过相应文献有用Qiangen的，还有Takara。第一个如您所说，贵，第二个公司逆转录的停产了。不过谢谢分享，谢谢

作者: huan1989111007 时间: 2015-1-2 19:08

惜名发表于 2015-1-2 14:44
你是做miRNA吧？我用天根的逆转录kit，跑出来循环数较高，25-30个吧。扩增曲线蛮好的~据另一个战友讲，QIAN ...

thanks. 确实是miRNA. 看过相应文献有用Qiangen的，还有Takara。第一个如您所说，贵，第二个公司逆转录的停产了。不过谢谢分享，谢谢

作者: muyujun123 时间: 2015-1-5 19:47

惜名发表于 2015-1-2 14:44
你是做miRNA吧？我用天根的逆转录kit，跑出来循环数较高，25-30个吧。扩增曲线蛮好的~据另一个战友讲，QIAN ...

能不能交流一下？你做exosome的mirna定量pcr所用的外参是什么？有用cel-mir-39的，这个是要在提取rna的时候另外加进去吗还是？

作者: 惜名 时间: 2015-1-7 10:20

muyujun123 发表于 2015-1-5 19:47
能不能交流一下？你做exosome的mirna定量pcr所用的外参是什么？有用cel-mir-39的，这个是要在提取rna的时 ...

外参？不知道还需要这个东西啊。。。我只用了内参

作者: muyujun123 时间: 2015-1-8 20:03

惜名发表于 2015-1-7 10:20
外参？不知道还需要这个东西啊。。。我只用了内参

内参？用的u6吗？但是我看文献里说，exosome里面的mirna是要用外参的啊，exosome里有u6吗？

作者: 惜名 时间: 2015-1-9 09:22

muyujun123 发表于 2015-1-8 20:03
内参？用的u6吗？但是我看文献里说，exosome里面的mirna是要用外参的啊，exosome里有u6吗？ ...

你有相关文献么？可以贴出来分享一下~我对这方面内容目前了解的不多，就以U6作为内参的，是可以跑出来的。设置外参的目的是什么呢？

作者: 木瓜31 时间: 2015-1-10 16:22

muyujun123 发表于 2015-1-8 20:03
内参？用的u6吗？但是我看文献里说，exosome里面的mirna是要用外参的啊，exosome里有u6吗？ ...

我也想了解这方面的知识，可以分享下相关文献吗？谢谢哦

作者: muyujun123 时间: 2015-1-14 17:05

惜名发表于 2015-1-9 09:22
你有相关文献么？可以贴出来分享一下~我对这方面内容目前了解的不多，就以U6作为内参的，是可以跑出来的 ...

因为exosome中u6的含量不太稳定，所以一般人为的加入外参来定量。我也不是很清楚，正在摸索。我觉得可能是加入标准品进行绝对定量吧

作者: huan1989111007 时间: 2015-1-16 22:45

muyujun123 发表于 2015-1-14 17:05
因为exosome中u6的含量不太稳定，所以一般人为的加入外参来定量。我也不是很清楚，正在摸索。我觉得可能 ...

可以贴出文献么？U6确实不太稳定表达。求助，相互探索。

作者: 大琳宝儿 时间: 2015-3-12 11:03
我也查了半天，觉得用u6的很少大家都用了什么啊

作者: wenzhouzsl 时间: 2015-4-28 21:45
Exosome 提RNA可以用trizol吗？

作者: yy8651 时间: 2015-4-29 16:31
请问您目前做的如何了？

作者: wenzhouzsl 时间: 2015-4-30 19:37
我昨天看了电镜，囊泡数量还行，但不知道是不是exosome。

作者: wenzhouzsl 时间: 2015-5-30 21:19
您好，我想问问您现在用的什么基因作为参照？内参or 外参？效果如何？

作者: wanghx_85 时间: 2015-6-12 08:52

惜名发表于 2015-1-9 09:22
你有相关文献么？可以贴出来分享一下~我对这方面内容目前了解的不多，就以U6作为内参的，是可以跑出来的 ...

我问过相关的技术支持，现在做exo的miR没有公认的内参（也就是说U6是不行滴），设置外参的目的是为了说明不同组别之间的差异并不是由于你操作问题导致的，比如上样量不一样，或是标本污染，我也没有特别搞懂，目前正在研究中，如果你有新进展，希望我们一起探讨~

作者: wanghx_85 时间: 2015-6-12 08:55
这是我昨天收到的技术支持发给我的文件，关于SBI研究外泌体miR的一些相关设计，感兴趣的可以看一下，我还没来得及看

，有兴趣大家一起交流下~[attach]161[/attach]

作者: limitzy 时间: 2015-6-18 14:24
学习了，谢谢

作者: kadak007 时间: 2015-9-7 09:53

惜名发表于 2015-1-2 14:44
你是做miRNA吧？我用天根的逆转录kit，跑出来循环数较高，25-30个吧。扩增曲线蛮好的~据另一个战友讲，QIAN ...

惜名版主，你有没有用过天根的miRNA荧光定量检测试剂盒？想请教下上游引物设计问题......

作者: 惜名 时间: 2015-9-7 10:06

kadak007 发表于 2015-9-7 09:53
惜名版主，你有没有用过天根的miRNA荧光定量检测试剂盒？想请教下上游引物设计问题...... ...

用过但是效果并不好。。。
引物是公司帮忙设计的我没设计过引物

作者: 惜名 时间: 2015-9-7 10:06

kadak007 发表于 2015-9-7 09:53
惜名版主，你有没有用过天根的miRNA荧光定量检测试剂盒？想请教下上游引物设计问题...... ...

用过但是效果并不好。。。
引物是公司帮忙设计的我没设计过引物

作者: kadak007 时间: 2015-9-7 10:11

惜名发表于 2015-9-7 10:06
用过但是效果并不好。。。
引物是公司帮忙设计的我没设计过引物

唉，感觉内心很忐忑呀，先硬着头皮试试吧

作者: huan1989111007 时间: 2015-9-7 21:46

惜名发表于 2015-9-7 10:06
用过但是效果并不好。。。
引物是公司帮忙设计的我没设计过引物

不好是怎样的？这方面太坑...

作者: huan1989111007 时间: 2015-9-7 21:47

kadak007 发表于 2015-9-7 10:11
唉，感觉内心很忐忑呀，先硬着头皮试试吧

最主要的是提取exosome的量，其次是逆转录的试剂盒。祝好运...

作者: huan1989111007 时间: 2015-9-7 21:48

kadak007 发表于 2015-9-7 10:11
唉，感觉内心很忐忑呀，先硬着头皮试试吧

最主要的是提取exosome的量，其次是逆转录的试剂盒。祝好运...

作者: huan1989111007 时间: 2015-9-7 21:50

kadak007 发表于 2015-9-7 09:53
惜名版主，你有没有用过天根的miRNA荧光定量检测试剂盒？想请教下上游引物设计问题...... ...

miRNA 一般有通用引物和特异性引物的。通用引物一般试剂盒中有，特异性引物自己购买即可。差别不大。

作者: kadak007 时间: 2015-9-8 09:50

huan1989111007 发表于 2015-9-7 21:50
miRNA 一般有通用引物和特异性引物的。通用引物一般试剂盒中有，特异性引物自己购买即可。差别不大。 ...

谢谢啊，准备近期试试，希望有结果...

作者: 木瓜31 时间: 2015-9-29 23:58
大家外泌体miRNA定量做得如何呢？我之前根据文献选了一个miRNA(miR-16)作为内参，但是似乎不太理想。。又在提取RNA时加入外参，但样本之间外参PCR的CT值并不十分接近。这是说明样本间RNA提取效率、RT-PCR的操作有问题，一致性差呢？还是无需在意，直接用(CT目的基因-CT外参）进行相对定量呢？个人觉得如果RT-PCR能够保证一致性较可（反转录前加入另一个spike in)而RNA提取效率不一致，即使样本RNA有损失，那是不是可以认为各种RNA均减少（外参与目的基因一起减少）？？求交流及赐教~

作者: 木瓜31 时间: 2015-9-29 23:59

wanghx_85 发表于 2015-6-12 08:52
我问过相关的技术支持，现在做exo的miR没有公认的内参（也就是说U6是不行滴），设置外参的目的是为了说明 ...

请问你现在如何定量呢？外参吗？

作者: fengshilou 时间: 2015-11-18 09:26

木瓜31 发表于 2015-9-29 23:58
大家外泌体miRNA定量做得如何呢？我之前根据文献选了一个miRNA(miR-16)作为内参，但是似乎不太理想。。又在 ...

我们目前也遇到了这种情况，就是每次PCR结果相差很大，标本和环境都换了，重复还是每次都不一致。不知道什么原因。

作者: arsenal-xie 时间: 2015-11-29 21:49

wanghx_85 发表于 2015-6-12 08:55
这是我昨天收到的技术支持发给我的文件，关于SBI研究外泌体miR的一些相关设计，感兴趣的可以看一下，我还没 ...

谢谢共享

作者: arsenal-xie 时间: 2015-11-29 21:52
我看文献里也还是使用U6做内参呢。JNCI 2015 107(7) doi:10.1093/jnci/djv135

作者: 旋转的尾音 时间: 2016-9-1 19:55

惜名发表于 2015-9-7 10:06
用过但是效果并不好。。。
引物是公司帮忙设计的我没设计过引物

惜名你好~~~想请教引物是哪个公司帮我设计的，求推荐~~~

作者: 惜名 时间: 2016-9-3 16:06

旋转的尾音发表于 2016-9-1 19:55
惜名你好~~~想请教引物是哪个公司帮我设计的，求推荐~~~

我找的biotnt，这家公司在上海貌似做了挺久的，我在他们那里做过好几次，感觉还行，哈哈

作者: 旋转的尾音 时间: 2016-9-4 11:28

惜名发表于 2016-9-3 16:06
我找的biotnt，这家公司在上海貌似做了挺久的，我在他们那里做过好几次，感觉还行，哈哈 ...

有家叫启因的公司，免费给设计合成，免费qPCR验证，我先找他们试试~
之前师兄说生工也不错的

作者: waimiti 时间: 2017-12-25 14:58

木瓜31 发表于 2015-9-29 23:58
大家外泌体miRNA定量做得如何呢？我之前根据文献选了一个miRNA(miR-16)作为内参，但是似乎不太理想。。又在 ...

请教一下您，您最后的问题解决没？我现在也有同样的困惑，谢谢

作者: zhouxinyu1995 时间: 2018-4-4 10:19
请问下大家我是用的10ml上清，用50kd的超滤浓缩管浓缩到500ul，并且用SBI的外泌体提取试剂盒提的外泌体。过夜后可见很多杂蛋白，用trizol提RNA后，用20ul无酶水溶解，总RNA浓度为50ng／ul，可得到几乎1ug的总RNA，OD值为1.4-1.5左右。请问大家这个RNA会不会太多了，可信吗？

作者: 胡杨 时间: 2018-4-19 10:37
你好，你10ng的RNA做出来了吗？因为我提取的RNA浓度也特别的少，你做的时候这个量少不少？

作者: geyulong 时间: 2018-5-24 15:18
您好，请问外泌体中的miRNA是使用什么方法提取的，谢谢了

作者: 奥比克 时间: 2018-6-2 17:11

Johnny 发表于 2015-4-29 10:56
可以

请问你提出来了吗，怎么验证的，量是如何确定的。。。。

作者: 奥比克 时间: 2018-6-2 17:17

胡杨发表于 2018-4-19 10:37
你好，你10ng的RNA做出来了吗？因为我提取的RNA浓度也特别的少，你做的时候这个量少不少？ ...

我也是提出来特别少，你是怎么确定量的，我是用nanodrop2000，测的38ng/ul

作者: acmdy1995 时间: 2018-7-26 21:23

惜名发表于 2015-1-9 09:22
你有相关文献么？可以贴出来分享一下~我对这方面内容目前了解的不多，就以U6作为内参的，是可以跑出来的 ...

你有没有测试过，总RNA一样的情况下，U6表达量是否恒定？

作者: 空调酱 时间: 2018-12-24 14:44

fengshilou 发表于 2015-11-18 09:26
我们目前也遇到了这种情况，就是每次PCR结果相差很大，标本和环境都换了，重复还是每次都不一致。不知道 ...

想问下这个问题解决没。我也是这样

作者: zhaozhi 时间: 2021-2-1 17:39
遇到瓶颈来看看

欢迎光临外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用 (https://www.exosome.com.cn/)

外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes &amp; microvesicles—小膜泡大作用

外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用