外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 外泌体RNA提取 [打印本页]
作者: 千夏的失火夏天    时间: 2016-2-27 20:25
标题: 外泌体RNA提取
想请教一下大家，提取外泌体RNA用的是什么试剂盒，提出来的浓度大概是多少，谢谢各位了~
作者: xinyi717    时间: 2016-3-16 23:15
同想向各位前辈请教，顶贴~
作者: 胖子的心境    时间: 2016-3-21 10:02
同问啊，有没有人做过
作者: hzangs    时间: 2016-3-21 12:20
trizol 或者随便用一个微量RNA提取试剂盒
我是用trizol的
作者: woshiyywlly    时间: 2016-3-22 14:18
trizol和trizol LS都可以，大概100ug exosome能提出0.5-1.5 ug 的RNA（从细胞上清中提取的exosome，RNA含量和细胞种类也有关系）
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-1 17:04
hzangs 发表于 2016-3-21 12:20
trizol 或者随便用一个微量RNA提取试剂盒
我是用trizol的

你好，请问50微升的PBS里，一般用多少trizol？
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-1 17:05
woshiyywlly 发表于 2016-3-22 14:18
trizol和trizol LS都可以，大概100ug exosome能提出0.5-1.5 ug 的RNA（从细胞上清中提取的exosome，RNA含量 ...

你好，请问50微升的PBS里，一般用多少trizol？
作者: hzangs    时间: 2016-4-1 19:33
旋转的尾音 发表于 2016-4-1 17:05
你好，请问50微升的PBS里，一般用多少trizol？

1ml  trizol就可以。 但是体系含水量高，你需要在加入异丙醇后再加入10%体积的3M醋酸钠去调一下体系盐离子强度 来促进RNA沉淀
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-5 10:45
hzangs 发表于 2016-4-1 19:33
1ml  trizol就可以。 但是体系含水量高，你需要在加入异丙醇后再加入10%体积的3M醋酸钠去调一下体系盐离 ...

感谢回复，请问是否有文献给我学习一下。之前提了一次，一个样本含量很低，另一个纯度不高，所以还在摸索阶段。
作者: hzangs    时间: 2016-4-5 10:50
旋转的尾音 发表于 2016-4-5 10:45
感谢回复，请问是否有文献给我学习一下。之前提了一次，一个样本含量很低，另一个纯度不高，所以还在摸索 ...

这方面的文献没读过。都是以前抽RNA的经验。  qiagen抽提膜泡内RNA的kit  我一个朋友使用过了，出来的量和我trizol抽提产量基本一样。 而且260/280的值  也基本都是一样，只有1.4-1.7那样。   确实产量低，也是因为这个原因，所以260/280对这个RNA质量没有什么评价意义
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-5 14:22
hzangs 发表于 2016-4-5 10:50
这方面的文献没读过。都是以前抽RNA的经验。  qiagen抽提膜泡内RNA的kit  我一个朋友使用过了，出来的量 ...

太感谢了，这个信息对我太有帮助了，谢谢分享~~~我之前尝试性提了两个，一个2.3ng/ul，比值1.97；一个65.6ng，比值1.48。正苦恼为什么比值这个样子。谢谢~
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-5 15:56
hzangs 发表于 2016-4-5 10:50
这方面的文献没读过。都是以前抽RNA的经验。  qiagen抽提膜泡内RNA的kit  我一个朋友使用过了，出来的量 ...

请问你这边的经验就是1ml TRIzol，然后室温放置多久？常规5min？谢谢。
作者: hzangs    时间: 2016-4-5 18:17
旋转的尾音 发表于 2016-4-5 14:22
太感谢了，这个信息对我太有帮助了，谢谢分享~~~我之前尝试性提了两个，一个2.3ng/ul，比值1.97；一个65. ...

后边的  65.6ng 比值1.48  和我之前抽提到的应该比较类似。

是的  5min
作者: 旋转的尾音    时间: 2016-4-5 22:33
hzangs 发表于 2016-4-5 18:17
后边的  65.6ng 比值1.48  和我之前抽提到的应该比较类似。

是的  5min

明白了，谢谢分享
作者: wjy    时间: 2016-7-23 15:27
hzangs 发表于 2016-4-5 18:17
后边的  65.6ng 比值1.48  和我之前抽提到的应该比较类似。

是的  5min

求问，求帮助，新手用TRIZOL提的外泌体总RNA也是这种情况，浓度比你好低，吸光度值1.48，根据吸光度值来看是不是蛋白和酚类污染啊？怎么解决啊？浓度还低。我的提的RNA想做二代测序，这种样品质量估计不行啊。
作者: hzangs    时间: 2016-7-24 17:15
wjy 发表于 2016-7-23 15:27
求问，求帮助，新手用TRIZOL提的外泌体总RNA也是这种情况，浓度比你好低，吸光度值1.48，根据吸光度值来 ...

这个好像没什么好办法。  能做的就是加大外泌体的起始量  然后可以提高最后抽提出的RNA的量  质量可能也会好一点
作者: wjy    时间: 2016-7-25 09:25
hzangs 发表于 2016-7-24 17:15
这个好像没什么好办法。  能做的就是加大外泌体的起始量  然后可以提高最后抽提出的RNA的量  质量可能也 ...

恩恩 ，我是刚开始做提RNA ,量是有点小，想先摸摸条件试一试。那污染那？看吸光度1.48不是蛋白污染吗？换成试剂盒提取效果会好吗？
作者: hzangs    时间: 2016-7-25 09:41
wjy 发表于 2016-7-25 09:25
恩恩 ，我是刚开始做提RNA ,量是有点小，想先摸摸条件试一试。那污染那？看吸光度1.48不是蛋白污染吗？换 ...

http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;page=11#pid7725  你可以看看这个贴子里的protocol

1.48 有点太低了   估计换kit  意义也不大。目前外泌体抽提RNA 好像没有见过效果很好的
作者: wjy    时间: 2016-7-25 10:30
hzangs 发表于 2016-7-25 09:41
http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=886&page=11#pid7725  你可以看看这个贴子里的 ...

恩恩好的谢谢你的帮助。
作者: wjy    时间: 2016-7-29 16:09
hzangs 发表于 2016-7-25 09:41
http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=886&page=11#pid7725  你可以看看这个贴子里的 ...

想像你你咨询一下，你外泌体提取的RNA有跑RNA电泳吗？有18s和28s的条带吗？我和细胞同时提取的总RNA,细胞内有18s和28s的核糖体RNA ,外泌体中啥条带都没有。
作者: wjy    时间: 2016-7-29 16:16
大家提取的外泌体总RNA 有跑过RNA电泳吗？第一条是DNAmarker(原谅没有RNAmarker),第二条是外泌体RNA(啥也没有，),第三条是细胞的RNA有18s和28s，大家跑都这样吗
作者: hzangs    时间: 2016-7-29 17:24
wjy 发表于 2016-7-29 16:09
想像你你咨询一下，你外泌体提取的RNA有跑RNA电泳吗？有18s和28s的条带吗？我和细胞同时提取的总RNA,细胞 ...

外泌体中是不会有18s 和28s的条带的。   RNA电泳是检测RNA灵敏度非常低的手段。你提取出的那点外泌体RNA 根本不足以让你在胶里看到。
作者: wjy    时间: 2016-7-29 17:29
恩恩，对，外泌体是没有rRNA,跑电泳没有的原因是RNA量太低了是吗？检测不到是吗？那怎么检测那？那细胞组从电泳上看应该是18S和28s吗？
作者: wjy    时间: 2016-7-29 17:31
hzangs 发表于 2016-7-29 17:24
外泌体中是不会有18s 和28s的条带的。   RNA电泳是检测RNA灵敏度非常低的手段。你提取出的那点外泌体RNA  ...

恩，对，外泌体是没有rRNA,跑电泳没有的原因是RNA量太低了是吗？检测不到是吗？那怎么检测那？那细胞组从电泳上看应该是18S和28s吗？你的外泌体提取的总RNA,怎么检测那？
作者: hzangs    时间: 2016-7-29 21:19
wjy 发表于 2016-7-29 17:31
恩，对，外泌体是没有rRNA,跑电泳没有的原因是RNA量太低了是吗？检测不到是吗？那怎么检测那？那细胞组从 ...

外泌体提取的总RNA  如果有条件 直接上agilent2100。没有条件的话 一般选取一两个比较常见的基因跑个qPCR看看， 比如GAPDH之类的基因。
作者: 完颜云裳    时间: 2016-8-6 17:13
这些问题对新手来说太有帮助了，我还想问一下大家提的外泌体RNA的吸收峰值是多少啊？我们的老是在270nm处，浓度1.5-1.6。
作者: 萤火虫    时间: 2016-11-9 10:56
你们有提取完外泌体之后不用PBS重悬直接用TRIZOL提取的吗？我用的是250ul的血清提取的外泌体，应该加多少量的TRIZOL比较合适呢，求指导，谢谢！
作者: wxy    时间: 2017-2-13 21:33
hzangs 发表于 2016-4-1 19:33
1ml  trizol就可以。 但是体系含水量高，你需要在加入异丙醇后再加入10%体积的3M醋酸钠去调一下体系盐离 ...

你好，关于加入异丙醇后再加百分之10的醋酸钠，这一步能不能详细的说一下呢，最好是步骤的那种，十分感谢
！
作者: dancing    时间: 2017-4-13 15:55
hzangs 发表于 2016-4-1 19:33
1ml  trizol就可以。 但是体系含水量高，你需要在加入异丙醇后再加入10%体积的3M醋酸钠去调一下体系盐离 ...

请问没有加pbs的外泌体里面也是用1mltrizol吗
作者: tianjing0312    时间: 2018-8-22 11:06
请问提rna需要多少外泌体的量呢？我是做的细胞上清 ， 可以大概告诉我需要多少上清 或者 外泌体particle 或者 ug数？
作者: guojishen    时间: 2021-4-2 10:27
woshiyywlly 发表于 2016-3-22 14:18
trizol和trizol LS都可以，大概100ug exosome能提出0.5-1.5 ug 的RNA（从细胞上清中提取的exosome，RNA含量 ...

外泌体的量怎么算呀请教一下
作者: xiaofeifei    时间: 2021-7-31 23:18
外泌体提取RNA测260/280没有意义，可以做RNA的nanochip，微量电泳确定RNA
作者: zhangwenying    时间: 2021-8-19 09:35
hzangs 发表于 2016-4-1 19:33
1ml  trizol就可以。 但是体系含水量高，你需要在加入异丙醇后再加入10%体积的3M醋酸钠去调一下体系盐离 ...

大神，有没有具体的TRIZOL法外泌体RNA步骤，可以分享一下吗？2561590328@qq.com，最近在提取血清外泌体RNA,一直没有沉淀,还想请教一下加入醋酸钠的量，感谢大神！
作者: 张旭    时间: 2021-9-8 16:40
你好，想咨询一下，提取出来的外泌体再提RNA时，需不需要考虑RIN值呢？使用安捷伦2100检测，RIN值基本上在2左右，不知道能不能建库，是必须要看RIN的吗
作者: kericnnoe1964    时间: 2023-1-19 01:44
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