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标题: 急！这是我整理的细胞免疫荧光步骤，大神帮我看看 [打印本页]

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作者: 八戒在五湖    时间: 2017-12-22 11:59
标题: 急！这是我整理的细胞免疫荧光步骤，大神帮我看看

细胞免疫荧光实验步骤，请大神帮忙看看有没有错的或需要注意的

1. 在六孔板中将已爬好细胞的玻片预温好的PBS浸洗3次；

2. 用4%的多聚甲醛4℃固定15min， PBS浸洗玻片3次，每次5min；

3. 0.2%Triton X-100( 4uL+4mLPBS )室温通透15min；

4. PBS浸洗玻片3次，每次5min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加封闭液（1%BSA in PBS + 0.05% Tween 20即0.1gBSA+10mLPBS+5uL Tween 20），室温封闭1h，封闭液浸没爬片；

5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗β-actin（封闭液稀释至5 µg/ml，稀释浓度依据的说明书）并放入湿盒，4℃孵育过夜；

6. PBS浸洗爬片3次，每次5min，吸水纸吸干爬片上多余液体

7. 滴加稀释好的荧光二抗，FITC标记山羊抗小鼠IgG (H+L)，稀释比例为1:500（用上述封闭液稀释），湿盒中37℃孵育1h；

8. PBS浸洗3次，每次5min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

9. 用吸水纸吸干爬片上的液体，滴一滴(20-50μl) 抗荧光衰减封片剂(含DAPI)于载玻片上，镊子小心夹起爬片，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片液，尽量避免气泡。 随后即可通过荧光显微镜观察样品。

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作者: dlwlrma    时间: 2017-12-28 14:38
我染核也是用的封片，但是染出来的核颜色分布不均匀，大家有遇到过类似情况吗

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