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标题: 外泌体处理细胞 [打印本页]

作者: 向荣y 时间: 2015-4-15 17:47
标题: 外泌体处理细胞
有没有做外泌体处理细胞的？一般设置什么样的浓度梯度啊？

作者: 惜名 时间: 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓度。
我个人经验，4ml上清提取的外泌体(DC来源)，用200-400ul PBS重悬，然后用100ul干预一个孔（6孔板，HUVEC），是可以得到阳性结果的。

作者: 丁倩倩 时间: 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为是提取试剂盒中携带的试剂毒性），我之前做过浓度梯度，现在一般都用10ug/ml

作者: ffp1988 时间: 2015-4-18 10:09

丁倩倩发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

您所说的10ug/ml是指？？外泌体的浓度？怎么测出来的？

作者: 惜名 时间: 2015-4-19 10:46

ffp1988 发表于 2015-4-18 10:09
您所说的10ug/ml是指？？外泌体的浓度？怎么测出来的？

10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为外泌体无法用Nano或电镜测浓度（或粒子数），文献多用蛋白量来间接反应外泌体浓度。
譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。
-------------------
这里还有一个问题，10ug/ml的浓度只是相对你的实验体系而言的，因为目前认为不同的提取方法会导致exo纯度不一。例如有人认为kit提取的exo含有杂蛋白，这无疑会增加裂解后测得的蛋白浓度，因此使得不同提取方法之间的“外泌体浓度”没有可比性。
梯度密度离心法得到的exo或许目前认为是最纯的。

作者: ffp1988 时间: 2015-4-19 12:12
您讲的非常详细，我在想如果exo被蛋白裂解液裂解后在取处理别的细胞，还能不能被摄取？
还是把提取的exo平分成两组，一组测浓度，一组做实验？？？？

作者: 丁倩倩 时间: 2015-4-19 21:43
惜名师哥已经说得很详细了

，你做干预的话不用裂解，直接用提取的exosome用BCA（或其他方法）测浓度就好，建议也是先做个浓度梯度

作者: huan1989111007 时间: 2015-4-19 22:59

惜名发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为 ...

非常详细，谢谢....

作者: 向荣y 时间: 2015-4-20 13:11

惜名发表于 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓 ...

多谢惜名！！我用的间充质干细胞外体，180ML上清重悬到1.2ml的PBS中，加到种有肿瘤细胞的96孔板里，做了四个梯度（以外体的体积为变量的），测的MTT结过飘忽不定，不知道是MTT实验本身的问题还是什么呢好纠结！

作者: hereissyk 时间: 2015-4-24 23:48
好贴，顶一下

作者: 向荣y 时间: 2015-4-26 19:01

Johnny 发表于 2015-4-20 14:19
换48孔板试试？还有多测几种可能对肿瘤细胞的影响，不要限于MTT，比如migration等其他肿瘤相关的指标 ...

嗯嗯只是提出来的外体太少不太够用的~

作者: 木瓜31 时间: 2015-6-25 12:58

丁倩倩发表于 2015-4-19 21:43
惜名师哥已经说得很详细了，你做干预的话不用裂解，直接用提取的exosome用BCA（或其他方法）测浓度就好， ...

不裂解直接用exosome重悬液测蛋白浓度，会比裂解后再测浓度低吗？

作者: 丁倩倩 时间: 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低

作者: kadak007 时间: 2015-6-25 23:38

丁倩倩发表于 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低

惜名在5楼回复时写到：“譬如，你有100ul PBS-exo，经裂解后测蛋白浓度，计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白（假设）。那么，这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔（2ml培养基）中，即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。”
仔细读完后，感觉他还是分两步走的，同时提2批等量的exo，1批裂解后测浓度；明确浓度后，另一批处理细胞。

作者: kadak007 时间: 2015-6-25 23:44

惜名发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为 ...

请教下，pbs-exo冻存于 --80℃，溶解后还能用来处理细胞吗？效果怎样呢？
谢谢~

作者: 惜名 时间: 2015-6-26 07:57

kadak007 发表于 2015-6-25 23:44
请教下，pbs-exo冻存于 --80℃，溶解后还能用来处理细胞吗？效果怎样呢？
谢谢~ ...

可以的，效果和新提的差不多，但是你不能在-80度放太久。
我个人经验，2-4周问题不大的。因为每次提出来量都很少，所以很快就用完了
也有人说可放数月。。。

作者: kadak007 时间: 2015-6-30 15:42

惜名发表于 2015-6-26 07:57
可以的，效果和新提的差不多，但是你不能在-80度放太久。
我个人经验，2-4周问题不大的。因为每次提出来 ...

处理细胞前，exo裂解后BCA测浓度，exo不裂解直接测浓度，这两种做法各有什么讲究吗?

作者: kadak007 时间: 2015-6-30 16:35
你好，请教下，做exo处理细胞时，每个孔里加多少细胞合适呢？总共需达到多大体积比较好呢？
譬如，25cm2规格培养瓶铺满时，细胞数大概是4-5*10^6，将这些细胞重悬于3ml的培养基，取多少加到孔里合适呢？

作者: 惜名 时间: 2015-7-1 08:22

kadak007 发表于 2015-6-30 15:42
处理细胞前，exo裂解后BCA测浓度，exo不裂解直接测浓度，这两种做法各有什么讲究吗? ...

是否需要裂解这个问题我看到论坛里有人讨论过。。。
这个我也搞不清楚，反正我每次都是裂解的，不管是测浓度还是跑western

作者: 惜名 时间: 2015-7-1 08:26

kadak007 发表于 2015-6-30 16:35
你好，请教下，做exo处理细胞时，每个孔里加多少细胞合适呢？总共需达到多大体积比较好呢？
譬如，25cm2规 ...

我做HUVEC（人脐静脉内皮细胞）的炎症反应，目测细胞密度50-95%的范围内都可以。
25cm2的瓶子面积为六孔板的2倍多一点，我手头的资料提示25cm2瓶子可以获得5*10^6个细胞，六孔板大约是2.5*10^。这样计算你1个瓶子分2个孔还是比较合适的。
当然，你能先摸一下条件是最好的。

作者: kadak007 时间: 2015-7-2 00:43

惜名发表于 2015-7-1 08:26
我做HUVEC（人脐静脉内皮细胞）的炎症反应，目测细胞密度50-95%的范围内都可以。
25cm2的瓶子面积为六孔 ...

非常感谢版主，完全取代了我老板的地位......

我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验每个孔里exo加多少微克起步呢？有没有一个比较大众化的浓度梯度？

作者: 惜名 时间: 2015-7-2 10:02

kadak007 发表于 2015-7-2 00:43
非常感谢版主，完全取代了我老板的地位...... 我打算拿大鼠肌细胞试下
你做的实验每个孔里exo加 ...

我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的蛋白，供你参考吧。
大约每孔加50ul PBS-exo悬液，每ul约0.2ug。

作者: kadak007 时间: 2015-7-3 16:23
惜名版主，用exo处理细胞，你有没有想过用小鼠源的细胞？毕竟后续功能实验时都得用小鼠的；
还是说，如果exo是人源的，那么处理的细胞也必须是人源的，功能实验时，不可能拿人做，只好用小鼠。
有没有纠结过这个问题？

作者: 惜名 时间: 2015-7-3 16:40

kadak007 发表于 2015-7-3 16:23
惜名版主，用exo处理细胞，你有没有想过用小鼠源的细胞？毕竟后续功能实验时都得用小鼠的；
还是说，如果ex ...

有纠结过啊。。。
但是现实条件所限啊，人源的HUVEC是最常见、也是比较容易获得的。

如果做miRNA，其实人源和小鼠源序列几乎都是一样的
如果做蛋白，或许有点顾虑。
不过anyway，这是没办法的折中了。毕竟不求大paper，只求毕业。。。

P.S. 你要点回复我，我才能看到消息，否则我收不到你的提问。。。

作者: kadak007 时间: 2015-7-4 11:17

惜名发表于 2015-7-3 16:40
有纠结过啊。。。
但是现实条件所限啊，人源的HUVEC是最常见、也是比较容易获得的。

呵呵，好的，感谢版主~

作者: 梦想照进现实 时间: 2015-7-8 10:17

惜名发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指，每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题，目前认为 ...

是否有文献支持~求文献细读，谢谢！

作者: 惜名 时间: 2015-7-8 10:54

梦想照进现实发表于 2015-7-8 10:17
是否有文献支持~求文献细读，谢谢！

这篇Nature immunology <Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-a-induced antiviral activity>，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation <Circulating Exosomes Induced by Cardiac Pressure Overload Contain Functional Angiotensin II Type 1 Receptors>用的是exo粒子数定量。
这篇JACC <Plasma Exosomes Protect the Myocardium From Ischemia-Reperfusion Injury>同时用了粒子数和蛋白质量。

其实任何一篇关于exo的文章，你仔细去找找，大都能找到一些剂量。

作者: 梦想照进现实 时间: 2015-7-8 11:02
谢谢！拜读

作者: kadak007 时间: 2015-7-20 20:56

惜名发表于 2015-7-2 10:02
我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的 ...

版主，请指导下，PBS-exo处理细胞，你一般让它们共同孵育多久呢？按小时算，还是按天算？

作者: 惜名 时间: 2015-7-21 08:49
本帖最后由惜名于 2015-7-21 08:54 编辑

kadak007 发表于 2015-7-20 20:56
版主，请指导下，PBS-exo处理细胞，你一般让它们共同孵育多久呢？按小时算，还是按天算？ ...

这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
--------------
如果你推测exo可以通过膜表面蛋白作用，那么时间应该是很快的，只要exo和细胞接触就可以作用了。然后你如果要检测mRNA表达，数小时就可以了。如果做蛋白，那就得16-24小时。
----------------
如果你推测exo是通过里面的miRNA作用，那么时间就得参照转染miRNA的了，例如，我看到的文献一般是在转染miRNA 36小时做检测。因为miRNA进到细胞还需要如靶序列结合、然后作用。

作者: kadak007 时间: 2016-3-14 16:05

惜名发表于 2015-7-21 08:49
这个恐怕得看你的exo通过什么途径发挥作用、以及你要检测什么。
--------------
如果你推测exo可以通过膜 ...

惜名版主，留言中提到 “做蛋白，16-24小时”，这个经验最开始有没有文献出处呢？可否推荐下？

作者: lucida1973 时间: 2016-7-15 03:16
这个帖子太需要了，谢谢给位的分享！！！！

作者: 中义 时间: 2016-9-29 13:49
感谢各位大神精彩讨论，学习学习！！！

作者: ashey 时间: 2016-10-13 17:08

向荣y 发表于 2015-4-20 13:11
多谢惜名！！我用的间充质干细胞外体，180ML上清重悬到1.2ml的PBS中，加到种有肿瘤细胞的96孔板里，做了 ...

你好，现在准备肿瘤细胞培养上清外泌体处理细胞了，不知道你180ml上清提取的外泌体浓度大概是多少啊？做MTT实验时加入最大外泌体浓度体积是多少？

作者: lucida1973 时间: 2016-10-31 19:37

惜名发表于 2015-4-16 11:08
用外泌体干预细胞没有可参考的依据。你可以自己做个浓度梯度，在我看的有限的文献里，似乎都没有提外泌体浓 ...

马克一下

作者: 雪岭御剑 时间: 2017-2-22 15:57

丁倩倩发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

请问你说的10微克每毫升是每次换液都加一次这么多外泌体吗？

作者: atlanticocean 时间: 2017-11-13 08:14

惜名发表于 2015-7-2 10:02
我用SBI提取的exo，得率之高令人乍舌。。。
所以我给出的浓度可能不是很准确，混杂了一些细胞培养液中的 ...

多大的孔？96孔板的孔？

作者: 赤道的边际 时间: 2020-12-9 12:53

惜名发表于 2015-7-8 10:54
这篇Nature immunology ，exo干预细胞基本都是用的5ug/ml；
这篇circulation 用的是exo粒子数定量。
这篇 ...

请问外泌体处理细胞时是直接加进去孵育吗？多久时间呢？需要spin down处理去孵育吗？

作者: minterist 时间: 2021-7-29 17:03

丁倩倩发表于 2015-4-16 20:57
我之前看的一篇文献10-50ug/mll都是可以的，200ug/ml以上会有脂毒性（我老板对这种说法一直嗤之以鼻，认为 ...

请问具体哪篇文章能分享一下吗？谢谢啦

作者: cyanwing 时间: 2022-2-12 23:41
感谢各位大神的指点！

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