关于质谱exosome or EVs的marker

微泡biomarker

各位大神大家好，近来在实验中发现WB和MS的蛋白鉴定结果又出入呢，一般 CD63和 ALIX 等都是WB能检测到的marker，那么有没有是用质谱能检测的marker呢，因为很多时候能WB出CD63等marker 但是MS检测不到呢？
请各位积极参与讨论，thank u

seallin

子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁上的血清，然后再用1 mL PBS重溶，枪头吹打均匀，加入终浓度10% （g/mL）的PEG，4度过夜，第二天离心获得沉淀，沉淀pellet按之前一样，用PBS清洗两遍以去除过量的PEG，最后用RIPA重溶进行破碎……

关键步骤有二点：1）二次沉淀前清洗尽量去除血清；2）二次沉淀后尽量去除PEG；

hzangs

这与质谱有关。 根据我打质谱的经验，一个靠谱的质谱平台可能比质谱仪本身更重要。  我们实验室也遇到过过表达蛋白之后，过表达细胞系和对照细胞系打质谱，然后差异蛋白里没有过表达的那个蛋白的情况。  你这个可能是质谱打的不好 o(╯□╰)o  

seallin

我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质谱上样量不会超过2微克，如果你的蛋白酶解产物中，血清蛋白占了绝大部分，那么结果就可想而知了，鉴定出来的肯定都是血清蛋白。因此，尽可能的除去血清蛋白极其重要，平时做wb外泌体清洗2遍，那么做质谱，请最好清洗3遍4遍。
2、样品预处理和质谱。一般商家的样品预处理都是很普通的方法，不会用很新很好的方法，因此样品处理中损失会很大，还会不可避免的引入SDS和NP40的干扰，影响质谱鉴定。质谱方面：质谱参数很多，许多要按照实际情况进行调节，比如样品复杂就要设长分离梯度；样品血清蛋白多，要设长动态排除时间等等。最后，商品化质谱测样，最好选thermo公司的质谱。

seallin

另外，有几个基因名一不小心会出错。比如大名鼎鼎的ALIX，真正的名字应该是PDCD6IP，还要CD225，真名是IFITM1，所以最后搜索可能会有所遗漏。

微泡biomarker

感谢大家的回复

子非鱼

seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么方法清洗？是超离之后大量PBS超离清洗？那对于试剂盒提取的外泌体可以用PBS重悬后二次沉淀吗，或者甚至三次沉淀......
2.对于血清外泌体打质谱，如何做到外泌体的清洗呢？
PS：实验室里无超离设备。期待您的回复！

seallin

子非鱼 发表于 2016-4-26 20:21
童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么 ...

很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般建议至少2次以上（PBS）；如果是试剂盒，两次沉淀就够了；qEV的话就太浪费了，不划算

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-3 09:19
很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般 ...

谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！但是细胞培液提取的exo，得到的蛋白比对ExoCarta等数据库，总体还不错。看到您的帖子，知道您擅长LC-MS这块，所以还想请教：SBI提取250ul血清的exo，kit沉淀要加大剂量PBS清洗然后再沉淀吗？二次沉淀时候加多少PBS？（最近的一片报道说PEG6000可以大量且经济的配制类似于kit的提取液，所以已购买PEG6000，决定拿这个来提取血清exo，并进行二次沉淀，就是不清楚要加多少量PBS二次沉淀来去除那些高丰度蛋白。。。有点啰嗦）
另外，因为也要做RNA深度测序，不知您涉及过吗，我提了2次RNA，总量在250ng左右，全部用来电泳，均没有见到条带。想请问一下问题出在那里，是总血清量少，还是冻存的exo的时候必需加trizo，不加就降解完了？期待您的回复！

seallin

子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

RNA这块我不是很擅长，所以也解决不了你的问题~~祝好运