PKH67染色

宋梦阳

请问大家知道PKH67怎么染外泌体吗，我看了试剂说明书只有怎么染细胞的，不知道怎么染外泌体，而且Diluent C溶液每次用很多，不敢浪费

宋梦阳

我发现我现在是加了1ul的PKH67与750ul的Diluent C混合，然后EXO与250ul Diluent Ca混合，这样很节省，效果也很好。如果大家想要具体方法的话可以找我要文献，很节省材料效果也很好！

惜名

是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy.



这篇文献用1ml Diluent C稀释，为了省钱，我降低到了0.3-0.5ml；效果一样赞~

wanghx_85

惜名 发表于 2015-12-18 08:44
这个要自己摸索浓度了。我做过6和12孔板，一般加30-100ul都可以获得满意结果。但是，也要根据你获得exo的 ...

惜名版主，根据您的指导，我写了个大概的染色步骤，请您再帮忙指导下看我的理解是否正确：
1、SBI提取外泌体，PBS重选EXO
2、PBS-EXO+1mlDiluent C混匀
3、4ul PKH67 + 1ml Diluent C混匀
4、将步骤3的试剂加入步骤2的液体中，4min
5、2ml BSA 终止染色
6、SBI试剂重提EXO
（注：试剂可按比例适当减量）
问题：整个操作过程是否需要避光？

wjy

wanghx_85 发表于 2016-1-21 11:59
我也不知道哪里出问题了，提了外泌体之后我就用100ulPBS重悬，然后开始PKH67染色，方法是：100ul Diluent C ...

我也做过这个实验，也是sigma的pkh26(红色膜染料)。我是先取1ulpkh26膜染料与100ulexo先孵育增加结合效率，然后加入1ml的 Diluent C，加入200ul1%BSA/PBS（我理解的加入200ul1%BSA/PBS的目的不是的终止反应，是增加连接效率，封闭非特异性的）。然后再体系中加入3ul的PKH26染料室温孵育20min,1h20min,10,0000g超速离心。获得的沉淀用100ul重悬。标记好的exo与细胞共孵育后再共聚焦显微镜下可以看到exo uptake cell

wenzhouzsl

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

惜大师，您说“Diluent C 降到了0.3-0.5ml"，也就是说PKH降到了1.3-2ul，对不？请问您的exosome有没有定量？大概多少微克？

惜名

wenzhouzsl 发表于 2015-8-28 15:51
惜大师，您说“Diluent C 降到了0.3-0.5ml"，也就是说PKH降到了1.3-2ul，对不？请问您的exosome有没有定 ...

大师不敢当
PKH还是4ul。exo只定量过一次，刚开始做鉴定时定量的，后来做功能都没定量（太费）。根据刚开始做定量的估计，exo为10-20ug（溶解在100ul PBS里面）。

yy8651

惜名 发表于 2015-8-28 17:46
大师不敢当
PKH还是4ul。exo只定量过一次，刚开始做鉴定时定量的，后来做功能都没定量（太费）。 ...

用什么方法定量？

惜名

yy8651 发表于 2015-8-28 19:24
用什么方法定量？

蛋白。

wooway

惜名 发表于 2015-8-22 10:15
是时候亮出这篇文献了：Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate ...

我想请教下如果我这里没有超速离心机，可否染色后再用EXOquick提取外泌体呢？大家是否有做过

惜名

wooway 发表于 2015-9-16 14:23
我想请教下如果我这里没有超速离心机，可否染色后再用EXOquick提取外泌体呢？大家是否有做过 ...

可以。
我就是这么干的。

巧露娜

惜名 发表于 2015-9-16 14:44
可以。
我就是这么干的。

请问可以用EXOquick提取之后在染色吗

惜名

巧露娜 发表于 2015-9-17 18:05
请问可以用EXOquick提取之后在染色吗

可以啊。。。
提取方法和染色没关系的，随便你染前怎么提、染后怎么提。。