外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 超速离心后，PBS洗多少次比较合适？ [打印本页]

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作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-18 16:19
标题: 超速离心后，PBS洗多少次比较合适？
采用经典protocol方法（PBS清洗一次）对细胞培养液中外泌体进行提取时，电镜做出来背景非常脏
大家一般清洗几次，多次清洗会不会导致外泌体破裂？

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作者: hzangs    时间: 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关，也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次

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作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-18 17:01

hzangs 发表于 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关，也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次 ...

有道理

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作者: 八戒在五湖    时间: 2017-4-23 10:01
楼主，我想问一下你提外泌体的protocol···

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作者: 北燕南飞    时间: 2017-4-24 14:54

八戒在五湖 发表于 2017-4-23 10:01
楼主，我想问一下你提外泌体的protocol···

300g 10min，取上清；2,000g 10min，取上清； 10,000g 30min，取上清； 100,000g 70 min，取沉淀；加PBS清洗， 100,000g 70 min

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作者: 八戒在五湖    时间: 2017-4-24 15:59

北燕南飞 发表于 2017-4-24 14:54
300g 10min，取上清；2,000g 10min，取上清； 10,000g 30min，取上清； 100,000g 70 min，取沉淀；加PBS ...

康萨米达~

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作者: afra    时间: 2017-5-9 16:58

hzangs 发表于 2017-4-18 16:59
这个可能和细胞系本身有关，也跟你使用的染料有关。脏东西可能是染料里的。  我是洗一次到两次   一般一次 ...

请问一下您超离后能看到沉淀吗

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作者: hzangs    时间: 2017-5-9 17:49

afra 发表于 2017-5-9 16:58
请问一下您超离后能看到沉淀吗

可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现

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作者: 步步唧唧    时间: 2017-5-9 19:31

hzangs 发表于 2017-5-9 17:49
可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现

问一下每次提取要多少癌细胞上清？我一般用30--40ml，最后提出来也就一点儿，200ul重悬，觉得量太少，实验室离心机转子配套管子太小了。

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作者: 弹珠1253    时间: 2017-5-10 21:42
小白请指教~请问下是否需要0.22 um微孔滤膜过滤呢？需要的话在第几步比较合适呢？

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作者: 北燕南飞    时间: 2017-5-15 20:53

弹珠1253 发表于 2017-5-10 21:42
小白请指教~请问下是否需要0.22 um微孔滤膜过滤呢？需要的话在第几步比较合适呢？ ...

我之前没有滤过，不过如果需要滤的话，应该在超离前

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作者: 弹珠1253    时间: 2017-5-15 20:59

北燕南飞 发表于 2017-5-15 20:53
我之前没有滤过，不过如果需要滤的话，应该在超离前

好的感谢！看到一个protocol就是在12000之后超离之前过滤，就按那个做了

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作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:05

步步唧唧 发表于 2017-5-9 19:31
问一下每次提取要多少癌细胞上清？我一般用30--40ml，最后提出来也就一点儿，200ul重悬，觉得量太少，实 ...

能不能把细胞培养上清取出来，先放-20度冰箱，多积累一些再用呢？

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作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:10

hzangs 发表于 2017-5-9 17:49
可以的。 非常少  非常小的沉淀。 不容易发现

那请问你用PBS清洗的话，如果沉淀很少，看不到的话，如何操作才能不把沉淀吸走？求技巧

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作者: meiling    时间: 2017-6-20 11:13
请问你是送公司做电镜的吗？哪个公司？价格是多少呀？

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作者: hzangs    时间: 2017-6-20 13:07

meiling 发表于 2017-6-20 11:10
那请问你用PBS清洗的话，如果沉淀很少，看不到的话，如何操作才能不把沉淀吸走？求技巧 ...

底部留一点液体   不吸走。  PBS洗后 用底部剩余的PBS 重悬

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作者: 步步唧唧    时间: 2017-6-20 14:56

meiling 发表于 2017-6-20 11:05
能不能把细胞培养上清取出来，先放-20度冰箱，多积累一些再用呢？

不知道哎！-20没试过。4度倒是试过 还可以提出来

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作者: meiling    时间: 2017-6-20 16:20

北燕南飞 发表于 2017-4-24 14:54
300g 10min，取上清；2,000g 10min，取上清； 10,000g 30min，取上清； 100,000g 70 min，取沉淀；加PBS ...

请问300g离心十分钟这一步可以省吗？因为离心后也看不到沉淀

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作者: 栾珍珠    时间: 2017-6-22 16:08

步步唧唧 发表于 2017-5-9 19:31
问一下每次提取要多少癌细胞上清？我一般用30--40ml，最后提出来也就一点儿，200ul重悬，觉得量太少，实 ...

同问啊！！！！！！！！！！

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作者: 栾珍珠    时间: 2017-6-22 16:10

hzangs 发表于 2017-6-20 13:07
底部留一点液体   不吸走。  PBS洗后 用底部剩余的PBS 重悬

亲，离心后重悬的pbs量太少，实验室超离的管子根本不配套，请问你是怎么做的呀？

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