PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复
本帖最后由 hzangs 于 2017-8-17 11:06 编辑文章及数据归属本人所有，未经本人书面许可，禁止转载，禁止使用本文数据。如有盗用，本人保留法律追究盗用者责任的权利。
文章进展介绍帖：http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=672&extra=page%3D1&_dsign=3be6f05a
之前在论坛里跟大家分享了【Sci Rep】上一篇关于使用PEG聚沉+超速离心清洗 的方法分离外泌体的protocol。近几天后台一直有朋友反映说无法重复paper里的数据。在此我将自己试用的数据分享给大家，希望能对大家有所帮助。还请大家尊重我的劳动成果，未经我的许可，请勿使用相关数据及图片。
首先分享我的protocol 给大家：
细胞使用含有10% exosome-free FBS培液培养48小时收培液。
1、蒸馏水121℃灭菌20min，冷却待用。
2、8g PEG6000 +2.922g氯化钠 溶于水中，定容至50mL。
3、0.45um 滤器，过滤除菌待用。
4、培液离心2000g 10min，10000g 30min 除去细胞碎片，上清转移至新管子。
5、培液加入等体积PEG溶液。4°过夜。
6、10000g 离心1h，收的沉淀。
7、沉淀重悬于PBS（极易溶解于PBS），超速离心110000g 70min 收的沉淀。
8、WB 鉴定。
图1：步骤6 沉淀
图2：丽春红染色
图3：WB 检测CD63和ALIX
wjy 发表于 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000 ...
是的。cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……
ALIX是CST的CD63 来自proteintech. 本帖最后由 hzangs 于 2016-5-18 14:10 编辑
pengqiao0605 发表于 2016-4-27 16:10
哇塞，你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。 ...
你用 巨噬细胞或者 胰腺癌细胞 就知道了:lol 那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊！
可能分泌旺盛的细胞外泌体释放量会比较高。 yayinano 发表于 2016-5-4 13:48
群主，你好，最近使用了你给出来的protocol，我用的是病人抽出来的血清（本人医生），1ml血清，加了1ml的PE ...
你还是需要参考一下原文的。只是我根据之前的一篇文献提供的方法做的。你要读一下原文看看他们是怎么做的。我发这个帖子主要目的就是验证一下他们方法的可行性，没有再做更多的尝试。 sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:18
请问用了多少血清？电镜有做吗？
这是用的细胞上清液。 没有拍电镜 sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:27
请问用了多少血清？
10%的FBS培液 请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000g超速离心两次的样品吗？还有一个想向你咨询一下，你的CD63和ALIX的抗体是哪家公司的呀？货号多少可以告诉我吗？最近想买抗体，所有想咨询一下你的抗体公司，谢谢:) 还有一个小小的问题请教，PEG和细胞上清液的样品过夜的时候，有没有搅拌过夜那？还是就混匀后静静的放在4℃冷库那？ wjy 发表于 2016-4-26 20:39
还有一个小小的问题请教，PEG和细胞上清液的样品过夜的时候，有没有搅拌过夜那？还是就混匀后静静的放在4℃ ...
混匀 然后静静的放着，静静会帮你的:lol hzangs 发表于 2016-4-26 21:20
混匀 然后静静的放着，静静会帮你的
哈哈哈谢谢解答 hzangs 发表于 2016-4-26 21:19
是的。cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……
ALIX是CST的CD63 来自proteintech....
可以不可告诉我具体货号那？感觉你的wb图做的棒棒哒哈。想买你的抗体试一试哈～你用过TSG101和CD9的抗体吗？都用哪家公司的那？效果怎么样那？ 你好，你的第一次离心就用的10000g, 有没有试过文献里的3000g呢？ 谢谢。 我们实验室的离心机达不到10000g, 要超离， 但是超离的管子形状又很纠结，很难收集沉淀。