八戒在五湖 发表于 2017-8-13 14:19:55

细胞上清超滤后用SBI试剂盒提外泌体中的问题


60mL用0.20滤膜过滤的细胞上清用100KD超滤管4000g，50min离心，收集大概600uL滤液
按5：1比例加入试剂，混匀，4℃过夜
1500g，30min离心，沉淀是深红色
PBS小心洗一遍，1500g，10min离心去上清，沉淀还是深红色，再用100uLPBS吹匀
跑western：CD9，CD63都没有条带
问题1：我在超滤过程中的时间是不是太长了，浓缩液体积太少，外泌体有没有可能挂在膜上？
问题2：沉淀是深红色正常吗，外泌体不应该是白黄色的么？


只是完美 发表于 2017-9-11 09:39:22

你好，请问你是怎么解决的呢？超滤后200ul，加PBS洗膜大约1ml，我用introvigen的试剂盒按照比例2:1，过夜10000g*1h，做BCA定量里面什么都没有，以前直接10ml用introvigen的试剂盒提大约0.2ug/ul.

qyjinghui 发表于 2017-9-14 08:53:38

老师您好，请问最终您解决问题了吗？我们新买了sbi的EXOquick-tc10A-1试剂盒，打算利用超离的方法浓缩一下再搭配试剂盒，不知道效果会怎样。

八戒在五湖 发表于 2017-9-15 10:47:20

只是完美 发表于 2017-9-11 09:39
你好，请问你是怎么解决的呢？超滤后200ul，加PBS洗膜大约1ml，我用introvigen的试剂盒按照比例2:1，过夜10 ...

首先我用无外泌体血清培养细胞的时间变成了48h，之前24，然后离心时间变短了，4000个g，20min，这样保留的体积增多了一些，然后在加的试剂，跑WB还可以

八戒在五湖 发表于 2017-9-15 10:48:49

qyjinghui 发表于 2017-9-14 08:53
老师您好，请问最终您解决问题了吗？我们新买了sbi的EXOquick-tc10A-1试剂盒，打算利用超离的方法浓缩一下 ...

超离？这个可以不用试剂盒了吧

烟尽云淡 发表于 2017-10-14 20:47:56

老师，您用的也是millipore 15ml 100kd的超滤管哇？这种管子只能装15ml的话，你们一般循环利用几次呢？

八戒在五湖 发表于 2017-10-18 09:46:39

烟尽云淡 发表于 2017-10-14 20:47
老师，您用的也是millipore 15ml 100kd的超滤管哇？这种管子只能装15ml的话，你们一般循环利用几次呢？ ...

可以重读利用很多次的，不用的时候把膜泡在20%乙醇里就行

kingsleysness 发表于 2017-10-18 16:00:57

我之前遇到过这种情况，原因是培养基浓缩的太过了，我是15ml浓缩到5ml，能做出来，再小了没试过，几百微肯定不行，盐离子浓度改变了，试剂盒没用了

qyjinghui 发表于 2017-10-29 17:20:49

楼主老师好，咨询您一个问题，我们想研究药物处理后外泌体内容物的变化，看到大致有两种收集cm的方式。1.加药处理2天，将含有药物的培养液丢弃，加上新鲜的培养基继续培养后再收集、分离外泌体。2.加药处理2天，直接收集含有药物的培养液分离外泌体成分。请问老师这两种，哪个更好呢，感谢回答，谢谢

本想自己发帖求教诸位大神，可是为什么我没法发帖子呢总是说我没有权限在该板块发布帖子，这是什么原因:Q

fananran2003 发表于 2017-11-25 09:57:13

楼主，请问您浓缩后超离exosome产量怎么样啊。我100ml浓缩到15ml然后超离什么都没提到，您 有经验赐教一下不？
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