外泌体-小膜泡大作用！ › 标记与追踪 › PKH67标记与追踪protocol

yuantingdong 发表于 2016-10-17 16:11:56

PKH67标记与追踪protocol

麻烦大家帮我看看行不行，谢谢！
PKH67标记与追踪protocol
1、SBI提取外泌体，200ulPBS重悬EXO2、取100ulPBS-EXO+0.5ml Diluent C混匀
3、4ul PKH67 + 0.5ml Diluent C混匀
4、将步骤3的试剂加入步骤2的液体中，4min
5、1ml 0.5%BSA 终止染色
6、SBI试剂重提EXO

SBI试剂盒提取外泌体：
1、细胞培养液离心，3000g *15min，取上清；
2、培养液上清与提取试剂(ExoQuick-TC)5:1混合，颠倒3次，静置12小时；
3、离心1500g *30min，吸除上清；4、离心1500g*5min，进一步去除残余上清；5、100ulPBS重悬

AI15777126378 发表于 2017-10-23 17:35:33

exosome的试剂盒抽提
1、10厘米皿细胞2.5x107，细胞贴壁后，更换培基，培养48h.
2、收集细胞上清液，4℃下2000g*20分钟（去除细胞及碎片）.
3、把上清液加入ultra15(3kd)中，4℃下5000g*30分钟，观察余液体积为1ml左右。余液体积过多可再离心3~5min（定角装子，加满12ml，如果不满12ml，可用PBS补齐，相应的离心时间要缩短）。
4、转移浓缩液至1.5ml离心管，按照5：1体积加入exoquick-tc exosome precipitation solution颠倒混匀。
5、冰箱孵育12h（放到摇床上）小时。
6、转移上清液至新离心管，1500g*30分钟，exosome在底部棕色或白色团块。如果，若得到红色团块，用PBS溶解再离心。
7、小心弃掉上清，1500g*5分钟，去除掉残余的上清。
8、所得团块就是exosome，用PBS溶解（100~ 200ul），-80℃下保存。（电镜分析的用多聚甲醛保存）

xixihaha 发表于 2016-10-29 22:27:29

好人，谢谢

cherry 发表于 2017-3-14 22:32:04

我觉得不行，我以前试过，提过感觉没什么东西了。因为我不想拿去超离，就想再用试剂盒重提一次。

william 发表于 2017-3-31 22:34:47

谢谢   .

五月灼蓁 发表于 2017-5-19 00:15:28

想问一下Diluent C具体是什么成分，有没有说明书可否发一份

AI15777126378 发表于 2017-10-23 17:27:29

你的提取方法有比较大的问题可能提出来的纯度可能不够

落叶知秋 发表于 2017-10-30 15:41:29

有样图吗？有的话可以给大家分享一下，尤其是当再次用试剂盒提取出来后，在加到细胞中去这个过程，最后显色的具体过程都能说一下

zhangning 发表于 2018-8-14 08:21:09

diluent c 怎么配的呀

luliang 发表于 2019-5-30 12:56:23

我分别用PKH67、DiI染料来标记外泌体，超离后在荧光显微镜下看，染料+PBS跟染料+外泌体的都有荧光，而且相差不大。我外泌体用量是100ul，35ug，PKH67、DiI都是4ul，请问这需要怎么解决。

查看完整版本: PKH67标记与追踪protocol