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外泌体浓度非常非常低

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发表于 2018-1-5 16:31:05 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 husthuagai 于 2018-1-5 16:50 编辑

我提取了几次外泌体,使用超速离心的方法。每次测的浓度都是特别低。具体如下:肿瘤细胞200ml培养48h的上清(去除外泌体的10%培养基),2000g 10min去除死细胞,使用超滤管浓缩到25ml,18,000g 20min去除细胞碎片,然后两次12万g 70min,最后离心后,我还是能看到明显的沉淀的,然后我用1ml PBS重悬,最后用0.22um滤器过滤。
这是我的简要步骤。
我在使用0.22滤器前和滤器后测浓度,bca法,分别是0.08ug/ul、0.05ug/ul。这也太低了!!!但是我明明看到沉淀了。这个我已经重复三次了。每次都差不多!
我真的好头痛,这到底是为什么?
求求哪位大神救救我,我真的找不到原因了!
先谢谢!!!
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发表于 2018-1-5 19:25:14 | 显示全部楼层
用1 mL PBS重悬。。体系太大了吧
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发表于 2018-1-5 16:51:26 | 显示全部楼层
1.沉淀量?拍个照更好参考
2.细胞量多少?或者说培养瓶或皿的细胞密度?
3.细胞类型会影响外泌体产量
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发表于 2018-1-5 16:57:56 | 显示全部楼层
是不是BCA测不出来?我用试剂盒提取的外泌体,用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法
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 楼主| 发表于 2018-1-5 17:03:23 | 显示全部楼层
芮苏遥 发表于 2018-1-5 16:51
1.沉淀量?拍个照更好参考
2.细胞量多少?或者说培养瓶或皿的细胞密度?
3.细胞类型会影响外泌体产量 ...

1.下次做的时候拍照上传给您看下
2,用的15cm的培养皿,都是长到70%左右换成去外泌体的培养基,然后48h,一般收上清时候>90%的密度
3. 膀胱肿瘤细胞系,我也是尝试了另一个细胞系,含量更加低。同时做电镜,现在的细胞系还能找到几个外泌体在一起的图片,另一个细胞系只能找到单个的外泌体图片,而且很少
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 楼主| 发表于 2018-1-5 17:09:56 | 显示全部楼层
蓝泪陨星 发表于 2018-1-5 16:57
是不是BCA测不出来?我用试剂盒提取的外泌体,用BCA测不出来。正在考虑用其它检测方法 ...

测不出来不可能吧,浓度很低,不要把你的外泌体稀释20倍,稀释10倍或者不稀释试试
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发表于 2018-1-5 20:35:24 | 显示全部楼层
husthuagai 发表于 2018-1-5 17:09
测不出来不可能吧,浓度很低,不要把你的外泌体稀释20倍,稀释10倍或者不稀释试试 ...

我说的“测不出来”指的是浓度很低(表达有误),和你差不多
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发表于 2018-1-6 15:38:28 | 显示全部楼层
裂解了吗 测之前?
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发表于 2018-1-6 19:32:01 | 显示全部楼层
同认为1ml太多了,试试100ul
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发表于 2018-1-7 00:30:01 | 显示全部楼层
husthuagai 发表于 2018-1-5 17:03
1.下次做的时候拍照上传给您看下
2,用的15cm的培养皿,都是长到70%左右换成去外泌体的培养基,然后48h, ...

细胞状态可以的话,尝试增加开始收集上清细胞密度(90%左右)和收集时间(我有试过最长96h的)。
15cm dish 我加12ml上清,试过life 试剂盒和超离,200ml上清超离所得沉淀我大概用了200ul重悬
还有微膜过滤步骤是必须的吗,会不会过滤损失掉?还有不清楚过滤会不会影响外泌体结构稳定
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