外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

 找回密码
 立即注册
查看: 6822|回复: 31

做WB前外泌体处理

[复制链接]

10

主题

38

帖子

178

积分

注册会员

Rank: 2

积分
178
QQ
发表于 2016-10-19 08:31:41 | 显示全部楼层 |阅读模式
请教一下,外泌体抽提后做WB,但不是立马做,是用PBS溶解放-80°C保存吗?如果这样,在提取蛋白之前用多大离心力可以把外泌体从PBS中分离沉淀出来?谢谢!
回复

使用道具 举报

0

主题

1

帖子

18

积分

新手上路

Rank: 1

积分
18
发表于 2017-10-31 21:09:07 | 显示全部楼层
步步唧唧 发表于 2017-6-29 11:05
版主 问一下 提取到的外泌体跑WB,是exo直接加缓冲液煮,然后直接做跑WB吗?那不是所有蛋白都会跑出来吗 ...

感觉这位层主连WB的原理都不清楚啊.... 敷抗体啊!
回复 支持 1 反对 0

使用道具 举报

0

主题

10

帖子

66

积分

注册会员

Rank: 2

积分
66
发表于 2017-6-9 15:30:23 | 显示全部楼层
请问用试剂盒提取的外泌体如何做WB
回复 支持 1 反对 0

使用道具 举报

10

主题

38

帖子

178

积分

注册会员

Rank: 2

积分
178
QQ
 楼主| 发表于 2016-10-21 11:23:43 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

请问版主,加loading煮了之后直接上样吗?我第一次听说可以这样,不提蛋白如何做WB,望不吝赐教!谢谢
回复 支持 1 反对 0

使用道具 举报

270

主题

1201

帖子

5708

积分

超级版主

Rank: 8Rank: 8

积分
5708
发表于 2016-10-19 20:57:56 | 显示全部楼层
yuantingdong 发表于 2016-10-19 16:51
但是重悬在PBS中后,就必须得超离后才能提蛋白,不能直接处理,问题是我这边不能超离,那是不是就得分开 ...

不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可
回复 支持 0 反对 1

使用道具 举报

0

主题

110

帖子

704

积分

高级会员

Rank: 4

积分
704
发表于 2017-6-29 11:05:05 | 显示全部楼层

版主 问一下 提取到的外泌体跑WB,是exo直接加缓冲液煮,然后直接做跑WB吗?那不是所有蛋白都会跑出来吗?怎么鉴定标志戴白CD9\CD63\TSG101什么的啊?如何区分?用什么Marker
回复 支持 0 反对 1

使用道具 举报

270

主题

1201

帖子

5708

积分

超级版主

Rank: 8Rank: 8

积分
5708
发表于 2016-10-19 09:48:30 | 显示全部楼层

回帖奖励 +2 金钱

一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的
回复 支持 反对

使用道具 举报

10

主题

38

帖子

178

积分

注册会员

Rank: 2

积分
178
QQ
 楼主| 发表于 2016-10-19 10:06:42 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

我们这边超速离心不方便,那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白?谢谢!
回复 支持 反对

使用道具 举报

0

主题

47

帖子

387

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
387
发表于 2016-10-19 10:33:04 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-10-19 09:48
一样要用超速离心才行。  如果你短期做的话  不必-80.  我试过  -20的样品  一周内 跑WB  没问题的 ...

斑竹   我看06年Thery的文章说 从人来源分离的外泌体时,裂解液不加DTT和巯基乙醇。请问你们一般用的是什么裂解液呢?还有就是论坛下载的06年Thery的文献只有29页,是不是还有补充呢?谢谢
回复 支持 反对

使用道具 举报

270

主题

1201

帖子

5708

积分

超级版主

Rank: 8Rank: 8

积分
5708
发表于 2016-10-19 14:42:34 | 显示全部楼层
yuantingdong 发表于 2016-10-19 10:06
我们这边超速离心不方便,那是不是意味着每次提外泌体之后就要立马提蛋白?谢谢! ...

一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中,取部分做蛋白定量,然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取一部分 加6*loading 煮
回复 支持 反对

使用道具 举报

10

主题

38

帖子

178

积分

注册会员

Rank: 2

积分
178
QQ
 楼主| 发表于 2016-10-19 16:51:44 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-10-19 14:42
一般我会把外泌体样品 重悬在约100ul PBS中,取部分做蛋白定量,然后剩下的直接冻在-20。  用的时候吸取 ...

但是重悬在PBS中后,就必须得超离后才能提蛋白,不能直接处理,问题是我这边不能超离,那是不是就得分开做?
回复 支持 反对

使用道具 举报

5

主题

72

帖子

355

积分

中级会员

Rank: 3Rank: 3

积分
355
发表于 2016-10-20 12:39:52 | 显示全部楼层
提外泌体蛋白不用裂解液么。先前我用RIPA感觉裂的不是很彻底,打算换4%的SDS呢。看好多文献直接加P
BS
回复 支持 反对

使用道具 举报

10

主题

38

帖子

178

积分

注册会员

Rank: 2

积分
178
QQ
 楼主| 发表于 2016-10-21 11:25:16 | 显示全部楼层
hzangs 发表于 2016-10-19 20:57
不用提蛋白。  直接吸几十微升 样品   加loading 煮 即可

版主有没有具体的步骤或者其链接或者文献,最近要做这个,谢谢了!
回复 支持 反对

使用道具 举报

您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

本版积分规则

关闭

站长推荐上一条 /1 下一条

QQ|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles   

GMT+8, 2019-11-14 07:57 , Processed in 0.134985 second(s), 9 queries , File On.

Powered by Discuz! X3.3

© 2001-2017 Comsenz Inc.

快速回复 返回顶部 返回列表