PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复

hzangs

Mars 发表于 2016-6-1 09:33
是不是文献里说的3214g，1h，4℃后的沉淀然后PBS重悬超离

嗯嗯。是的

hzangs

Mars 发表于 2016-6-1 22:55
楼主问一下，最后一步超离，你离心几次，每次多久，谢谢

一次。 70min

hzangs

Mars 发表于 2016-6-3 16:33
最后超离后用多少PBS重悬呢？

1ml-30ml 都可以。  条件允许的话 就用大一点的体积

hzangs

pytruth 发表于 2016-6-1 15:21
那就是说超速离心法分离出的外泌体是最多的了？如果用60ml的上清液提取出的外泌体够做些什么呢？WB或者电 ...

足够做WB 和 电镜了。   至于 饥饿培养是不是增加外泌体释放， 这个我没有见到类似的报道。

hzangs

gracexiguan 发表于 2016-6-4 20:04
请问用了多少细胞上清啊？谢谢

不同细胞系产量不一样的。 这是一个外泌体产量很高的细胞系   用了几毫升培液分到的。

hzangs

wangjkm 发表于 2016-6-5 19:00
楼主，我想咨询一下，外泌体具体WB怎么跑？提取出来后用少量PBS重悬后，需要超声和BSA测浓度吗？还是直接加 ...

我收到外泌体后 会直接使用BCA 定量，然后loading buffer 煮。 没有额外的裂解步骤。

hzangs

wangjkm 发表于 2016-6-5 20:43
20ul体系的话，基本上都上多少蛋白呢？

这要看你起始的培液体积  以及你的使用的细胞系是否是外泌体释放量比较高的细胞系。

hzangs

gracexiguan 发表于 2016-6-6 11:02
您BCA测浓度能测到多少呢？

100ng/ul 左右的蛋白浓度

hzangs

Mars 发表于 2016-6-7 10:01
楼主最近用了50ml上清提取外泌体PEG6000法，超离前隐约看到点，超离后完全看不到啊，这个怎么整 ...

这个问题描述有点太模糊了……  
但是你可以尝试 在超离前取一部分样品 跑个WB 看看有没有exosomes的marker， 以判断 是超离前的问题还是超离后的问题。

hzangs

Mars 发表于 2016-6-7 10:24
好的，就是我正常离心超离前有一个3000多g的离心1h,这个时候还能勉强看到，然后超离啥也看不多 ...

如果有条件的话， 你可以考虑直接10000g 去离心1个小时