PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复

hzangs

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文章进展介绍帖：http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=3be6f05a
之前在论坛里跟大家分享了【Sci Rep】上一篇关于使用PEG聚沉+超速离心清洗 的方法分离外泌体的protocol。近几天后台一直有朋友反映说无法重复paper里的数据。在此我将自己试用的数据分享给大家，希望能对大家有所帮助。还请大家尊重我的劳动成果，未经我的许可，请勿使用相关数据及图片。


首先分享我的protocol 给大家：


细胞使用含有10% exosome-free FBS培液培养48小时收培液。


1、蒸馏水121℃灭菌20min，冷却待用。


2、8g PEG6000 +2.922g氯化钠 溶于水中，定容至50mL。


3、0.45um 滤器，过滤除菌待用。


4、培液离心2000g 10min，10000g 30min 除去细胞碎片，上清转移至新管子。


5、培液加入等体积PEG溶液。4°过夜。


6、10000g 离心1h，收的沉淀。


7、沉淀重悬于PBS（极易溶解于PBS），超速离心110000g 70min 收的沉淀。


8、WB 鉴定。




图1：步骤6 沉淀

图2：丽春红染色
图3：WB 检测CD63和ALIX

hzangs

sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:18
请问用了多少血清？电镜有做吗？

这是用的细胞上清液。 没有拍电镜

hzangs

sakura_lan 发表于 2016-4-26 14:27
请问用了多少血清？

10%的FBS  培液

hzangs

wjy 发表于 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000 ...

是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.

hzangs

wjy 发表于 2016-4-26 20:39
还有一个小小的问题请教，PEG和细胞上清液的样品过夜的时候，有没有搅拌过夜那？还是就混匀后静静的放在4℃ ...

混匀 然后静静的放着，静静会帮你的

hzangs

wjy 发表于 2016-4-26 23:00
可以不可告诉我具体货号那？感觉你的wb图做的棒棒哒哈。想买你的抗体试一试哈～你用过TSG101和CD9的抗体 ...

ALIX #2171（CST）
CD63 #25682-1-AP （proteintech）
TSG101 #ab133586 （abcam）
这三只抗体的效果都很好。 你可以尝试。 我一直用的都是这三个。
CD9 没有用过。  希望这些东西对你有所帮助

hzangs

yueyujiaexo 发表于 2016-4-26 23:00
你好，你的第一次离心就用的10000g, 有没有试过文献里的3000g呢？ 谢谢。 我们实验室的离心机达不到10000g, ...

第一次 3000g 我还真没有尝试过。
只要有沉淀，基本里面就有外泌体的~

hzangs

wjy 发表于 2016-4-26 23:13
非常的感谢 你哈 莫名的崇拜哈

论坛嘛， 就是大家相互讨论，相互帮助的地方。不用谢~

hzangs

pengqiao0605 发表于 2016-4-27 14:49
请问楼主收集这些沉淀用了多少的细胞上清？

这是一个外泌体释放量十分大的细胞。  收集这些外泌体 大概用了7ml 培液

hzangs

pengqiao0605 发表于 2016-4-27 16:10
哇塞，你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。 ...

你用 巨噬细胞  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊！
可能分泌旺盛的细胞  外泌体释放量会比较高。