PEG聚沉+超速离心 试用报告 ：Sci Rep文章技术重复

hzangs

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文章进展介绍帖：http://www.exosome.com.cn/forum. ... amp;_dsign=3be6f05a
之前在论坛里跟大家分享了【Sci Rep】上一篇关于使用PEG聚沉+超速离心清洗 的方法分离外泌体的protocol。近几天后台一直有朋友反映说无法重复paper里的数据。在此我将自己试用的数据分享给大家，希望能对大家有所帮助。还请大家尊重我的劳动成果，未经我的许可，请勿使用相关数据及图片。


首先分享我的protocol 给大家：


细胞使用含有10% exosome-free FBS培液培养48小时收培液。


1、蒸馏水121℃灭菌20min，冷却待用。


2、8g PEG6000 +2.922g氯化钠 溶于水中，定容至50mL。


3、0.45um 滤器，过滤除菌待用。


4、培液离心2000g 10min，10000g 30min 除去细胞碎片，上清转移至新管子。


5、培液加入等体积PEG溶液。4°过夜。


6、10000g 离心1h，收的沉淀。


7、沉淀重悬于PBS（极易溶解于PBS），超速离心110000g 70min 收的沉淀。


8、WB 鉴定。




图1：步骤6 沉淀

图2：丽春红染色
图3：WB 检测CD63和ALIX

hzangs

wjy 发表于 2016-4-26 20:26
请问一下你的cell1和cell2超速离心是我们正常超速离心的方法分离exosome，就是上清去杂质之后，直接100,000 ...

是的。  cell1 超离分离的时候出了点问题，没有收到……

ALIX是CST的  CD63 来自proteintech.

hzangs

pengqiao0605 发表于 2016-4-27 16:10
哇塞，你用的这细胞可真够给力的。我用的是T淋巴细胞系100ml上清也就做了个电镜。 ...

你用 巨噬细胞  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊！
可能分泌旺盛的细胞  外泌体释放量会比较高。

hzangs

yayinano 发表于 2016-5-4 13:48
群主，你好，最近使用了你给出来的protocol，我用的是病人抽出来的血清（本人医生），1ml血清，加了1ml的PE ...

你还是需要参考一下原文的。  只是我根据之前的一篇文献提供的方法做的。  你要读一下原文  看看他们是怎么做的。  我发这个帖子  主要目的就是验证一下他们方法的可行性，没有再做更多的尝试。

dajigeaitt

yayinano 发表于 2016-5-4 15:23
谢谢楼主，我在具体看下，血清的，文章里面也没有很具体的描述，头疼中，还有一个技术问题想问下群主，exos ...

前辈你好，我也刚做血清的，请问您现在进展如何？我目前选择的内参是U6，但好多文献选择加外参如miR39，恳请前辈赐教相关经验

好好学习

感谢楼主的无私分享

lwj

hzangs 发表于 2016-4-27 16:54
你用 巨噬细胞  或者 胰腺癌细胞 就知道了   那产量，简直是细胞把自己粉碎了 然后往外吐 exosome啊！ ...

请问你用的巨噬细胞是什么来源的？

想有一篇JCR

hzangs大神，我也用巨噬细胞，是RAW264.7，我想用细胞因子促进细胞分化成M1型和M2型提取外泌体，请问你做过这类实验吗，容不容易分化，因为sigma的细胞因子有点贵还不敢买来尝试

ljcheshen

请问用这个方法如何分离血浆外泌体呢，我看了那篇文章，但是没有找到用这个方法离心体液外泌体的方法，麻烦楼主指点

kefeng

您好，我想请问一下，不同细胞分泌的外泌体有什么不同，还有就是哪些细胞分泌的外泌体多一些，有没有相关的参考文献讲这些的。谢谢啦

weixiao

版主好，我看到这个有个问题，如果用含有病毒的细胞上清分离外泌体，那PEG沉淀法会不会把病毒也沉淀下来？那最后一步用PBS洗，然后超离，能把病毒和外泌体分开吗？因为如果后面想要研究外泌体是否能够传输某病毒，这里会产生干扰吗？

bertrand

这个方法适合提取血浆外泌体吗？

wuguo0898

初步实验   可以试一试

桃花灼灼

hzangs 发表于 2019-1-17 19:05
NTA用量不大。 但是电镜用量可不小。  如果起始体积小了， 电镜下找不到结构。 ...

恩恩好的，本来是打算先送样去做NTA，再做电镜的，我是用的试剂盒提外泌体，50ml细胞上清提的外泌体去做NTA可以吗