本帖最后由 Johnny 于 2018-4-27 16:37 编辑
如何大规模生产符合GMP要求的临床级外泌体用于癌症治疗？
在外泌体领域发表了2篇Nature大作的MD安德森癌症中心的Raghu Kalluri博士是外泌体领域大牛之一。 2015年，Kalluri博士在Nature杂志发表外泌体文章，报道了血液循环中的GPC1阳性的外泌体作为早期胰腺癌非侵入式液体活检方案的可能性。随后创立Codiak BioSciences公司，专注研发基于外泌体的诊断与治疗产品。截至目前，Codiak总共募集了总1.685亿美元的投资。 2017年，Kalluri博士又在Nature杂志发表外泌体文章，报道了外泌体作为RNAi的有效载体的可能性。该研究利用成纤维细胞生产外泌体，经电转方法将靶向突变KRAS的siRNA导入外泌体制成iExosome。由于该外泌体本身携带CD47，可减少被循环单核细胞清除。iExosome顺利到达癌细胞后，将siRNA递送到癌细胞中，从而抑制KRAS GTPase活性以及下游的RAF-MEK-ERK或PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活，最终抑制肿瘤的生长和转移。 这是实验室的研究性工作。外泌体治疗癌症的临床转化应用，首先第一步要解决的就是如何生产临床级GMP外泌体。 最近，Kalluri博士在JCI insight杂志上发表文章，阐述了临床级外泌体的生产和质检流程。该研究报告了采用GMP标准的基于生物反应器的大规模临床级外泌体生产方法。建立了标准操作流程以生产具有靶向致癌Kras能力的工程化外泌体（iExosomes）。在多个体外和体内研究中测试了临床级GMP iExosomes，证实了致癌Kras的抑制和几种胰腺癌小鼠模型的存活增加。该研究还探究了这种临床级iExosome的保存期限、体内分布、毒理学特征以及与化学疗法结合的功效，为GMP iExosomes的未来临床试验建立基础。总的来说，该研究阐明了产生用于各种人类疾病治疗的临床级外泌体的过程和可行性。 简要来说，GMP iExosomes的生产就是利用生物反应器来大规模培养细胞。通过生物反应器可定期收获大量的培养上清，每次收集培养上清都进行无菌（确保没有厌氧菌、需氧菌）检测、内毒素（<1 EU/mL）和支原体（PCR，阴性）检测。收集好的上清可以先放-80度冻存。待攒至足量后将上清置于4度过夜解冻，利用超速离心法提取外泌体。1000g 4°C离心15分钟→0.2过滤→100000g离心3小时→得到外泌体沉淀→用CB（clinical buffer）重悬，每100 mL上清的到的外泌体沉淀用4 mL重悬。在分次离心的过程中，外泌体CB溶液会在4度最长保存72小时以将所有外泌体汇总在一起处理。最终得到了72 mL的外泌体CB溶液。取其中的0.5 mL用于纳米颗粒检测、1 mL用于流式检测、0.5 mL用于内毒素检测、1 mL用于无菌检测。剩余69 mL分装2 mL一支，冻存于-80度，或经工程化处理（电穿孔将靶向致癌Kras的siRNA导入）后再分装冻存。 GMP级MSC源外泌体生产 在GMP级MSC源外泌体的生产、鉴定和各项质量控制完成后，在体外和体内验证了其对胰腺癌的治疗作用、以及与化疗药物联合用药时的作用。
GMP级iExosome的体外效用。可以看到GMP级iExosome可显著增加肿瘤细胞凋亡，减少突变KRAS的基因表达。 GMP级iExosome在小鼠体内的效用。GMP级iExosome显著抑制了肿瘤的生长，增加了胰腺癌模型小鼠的存活。 GMP级iExosome与化疗药物吉西他滨（gemcitabine）联合用药的作用。 外泌体在小鼠体内的分布。可以看出，携带肿瘤的小鼠在静脉内给外泌体后，显示出在肿瘤位置的特异性积累。 GMP级iExosomes的稳定性。从图中可以看出，GMP级iExosomes在-80度最长冻存6个月后，其数量（A）、大小（B）、形态（C）、蛋白marker（D）方面无明显下降；在促进肿瘤细胞凋亡方面，冻存对GMP级iExosomes也无明显影响，但是在室温或4度保存超过2天会显著降低其作用效果。 GMP级iExosomes在体内效用上的稳定性。同样可以看出，冻存对GMP级iExosomes的体内效用也无明显影响，但是在室温或4度环境下保存不宜超过2天。总结一下，GMP级iExosomes可在-80度保存6个月，4度或室温条件下保存2天。 该研究报告了从骨髓来源MSC大规模生产符合GMP标准外泌体的方法。提供了详细的操作流程，克服了生产临床用治疗性外泌体存在的几个障碍。制定了符合GMP标准流程的iExosomes大规模生产及质量控制的标准。这些标准包括确定外泌体制剂的尺寸分布、外泌体标志物的分析、和效力测定。该研究报道为外泌体的临床治疗应用奠定了良好的基础。
参考文献： Mendt, M., et al. (2018). "Generation and testing of clinical-grade exosomes for pancreatic cancer." JCI Insight 3(8). 附件已隐藏，回复该贴可查看附件 附件已隐藏，回复该贴可查看附件
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|Archiver|手机版|外泌体之家 | exosomes & microvesicles
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