外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

标题: 求助！关于凯杰exoEasy Maxi kit提取的exosome的WB [打印本页]
作者: 18940258208    时间: 2017-5-30 18:50
标题: 求助！关于凯杰exoEasy Maxi kit提取的exosome的WB
求助！关于exosome蛋白的western blot，我做的是CD63的鉴定，用的是Qiagen厂家的exoEasy Maxi kit试剂盒提取的细胞上清15ml的外泌体（共6个不同时间点的样本），最后溶于500ul XE buffer。前后一共做了6次WB，起初是没有用裂解液，配的10%胶，直接取20ul加相应的loading buffer，100度变性后上样，然后出来的条带是连续一条直线，之后改了各种试剂及条件，仍是一条线，我怕是自己的技术问题，同时期同条件下还跑了以前剩余的普通蛋白标本，杂的是GAPDH，跑出来的泳道间隔都没问题，证实我的技术还行。于是在最后一次加了裂解液（MPER+PMSF）后，显影竟然是白板，Oh MY GOD，我想死的心都有了。也翻阅了好多文献，但是都不是说的很具体详细。寻寻觅觅终于找到组织了，求助各位大神
作者: hzangs    时间: 2017-5-31 09:22
15ml 上清， 洗脱500ul  取20ul 跑WB。  感觉样品用的少了。  你使用的什么细胞系？
作者: katuysha    时间: 2017-5-31 11:07
估计是你的洗脱体系太大了，用100ul左右洗脱可能会好一点。
作者: katuysha    时间: 2017-5-31 11:08
hzangs 发表于 2017-5-31 09:22
15ml 上清， 洗脱500ul  取20ul 跑WB。  感觉样品用的少了。  你使用的什么细胞系？ ...

想问下版主，最近在用什么方法提exosomes?
作者: 18940258208    时间: 2017-5-31 13:52
hzangs 发表于 2017-5-31 09:22
15ml 上清， 洗脱500ul  取20ul 跑WB。  感觉样品用的少了。  你使用的什么细胞系？ ...

回答版主，用的是人胚肺细胞
这是凯杰的说明书
首先要求的量：This protocol is for purifying exosomes and other EVs from 0.2–4ml of serum or plasma, or
from up to 16 ml of cell culture supernatan
其次，洗脱的量Add 400 μl Buffer XE to the membrane and incubate for 1 min. Centrifuge at 500 x g for
5 min to collect the eluate.
Note: Using less than 400 μl elution buffer will result in incomplete elution. Eluates can
be concentrated e.g., using ultrafiltration. If an ultrafiltration step will be performed,
eluting in 1–2 ml Buffer XE is recommended
作者: 18940258208    时间: 2017-5-31 13:52
katuysha 发表于 2017-5-31 11:07
估计是你的洗脱体系太大了，用100ul左右洗脱可能会好一点。

亲，我用的是凯杰的专门提取盒子，要求是至少400ul
作者: hzangs    时间: 2017-5-31 15:35
katuysha 发表于 2017-5-31 11:08
想问下版主，最近在用什么方法提exosomes?

超离，基本一直在超离。
作者: hzangs    时间: 2017-5-31 15:37
18940258208 发表于 2017-5-31 13:52
回答版主，用的是人胚肺细胞
这是凯杰的说明书
首先要求的量：This protocol is for purifying exosomes  ...

人胚肺细胞   原代的？还是细胞系？
16ml一般来说确实不多。 如果用400ul洗脱  可能确实浓度很低了。
另外 你所描述的 “ 一条线 ”  是什么意思？
作者: 18940258208    时间: 2017-5-31 16:19
file:///C:/Documents%20and%20Settings/Administrator/%E6%A1%8C%E9%9D%A2/exosome.gif
不知版主能否看见图片
人胚肺细胞是细胞系的
作者: 18940258208    时间: 2017-5-31 16:19
本帖最后由 18940258208 于 2017-5-31 16:21 编辑

不好意思，不知道该怎么发图片
作者: 18940258208    时间: 2017-5-31 16:23
hzangs 发表于 2017-5-31 15:37
人胚肺细胞   原代的？还是细胞系？
16ml一般来说确实不多。 如果用400ul洗脱  可能确实浓度很低了。
另 ...

6个不同时间点的exosome标本，看不见泳道全连成一条线了，而且中间还特意留了一个空白孔
作者: katuysha    时间: 2017-5-31 22:00
hzangs 发表于 2017-5-31 15:35
超离，基本一直在超离。

去年那个PEG沉淀法还用吗？
作者: hzangs    时间: 2017-6-1 11:03
katuysha 发表于 2017-5-31 22:00
去年那个PEG沉淀法还用吗？

用的不多了。 提取RNA 个别时候偷懒 会用PEG
作者: katuysha    时间: 2017-6-1 14:51
hzangs 发表于 2017-6-1 11:03
用的不多了。 提取RNA 个别时候偷懒 会用PEG

好的，谢谢了。
作者: 范范    时间: 2017-9-7 23:23
请问楼主觉得这款试剂盒提取外泌体效率和纯度怎么样呢，最近刚入手准备做呢，想请教一下楼主每次用多少量的细胞上清呢，最后用多少量 BUFFER XE洗脱呢，还有就输这个柱子可以重复利用吗？问题有点儿多。。。还望楼主不吝赐教
作者: 蓝泪陨星    时间: 2017-12-7 21:39
有没有用BCA 测蛋白浓度？如果测了浓度多少？我之前也是用的这个试剂盒，感觉提出来的外泌体量太少了：16ml上清，只有几十微克每毫升的外泌体。
作者: smile扣子    时间: 2018-3-5 09:39
蓝泪陨星 发表于 2017-12-7 21:39
有没有用BCA 测蛋白浓度？如果测了浓度多少？我之前也是用的这个试剂盒，感觉提出来的外泌体量太少了：16ml ...

我做了几次直接测浓度太低不显示，冻干蛋白后浓度才勉强到1，做WB效果很差，请问有新进展吗？
作者: EVA120120    时间: 2018-8-5 19:30
BCA法测浓度时，需要先将外泌体裂解吗？
作者: wwpapple    时间: 2018-11-14 10:00
您好，请问您用凯杰的这个试剂盒提15ML细胞上清，获得的外泌体的量可以用BCA检测到吗？谢谢
作者: zhaozhi    时间: 2021-1-22 20:40
请问楼里的人：该试剂盒提取的外泌体中途用XE BUFFER 洗脱后，后续WB鉴定是直接就加裂解液了吗？




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