关于质谱exosome or EVs的marker

seallin

子非鱼 发表于 2016-5-5 15:46
很详细，很感谢！！！我提取细胞外泌体就按这个protocol了（看到“过夜“俩字，直觉是细胞配液的提取方法 ...

血清其实就是将培养液浓缩10倍的东东，差不多，由于血清量一般比较少，所以清洗次数差不多就行，量最好不要减少，毕竟血清蛋白浓度极高。告诉你一个诀窍，由于酚红和蛋白之间存在疏水相互作用，因此可以用酚红的颜色程度来判断血清蛋白的污染，一般二次沉淀之后，是不会有蛋白残留的，只有外泌体，所以如果沉淀是雪白色的，那就说明比较纯了。如果带一点浅黄甚至棕色，那肯定没洗干净。这些东西，我肯定不会写在文章里的，文章最近发表在Analyst上，到时候多多引用哦~~

微泡biomarker

seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

您好：  感谢您的回复，我们现在一般质谱样本制备的方式都是FASP 酶解，溶液体系是碳酸氢铵。加DTT 和IAA 最后是酶。

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-5 14:07
我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁 ...

很详细，很感谢！！！我提取细胞外泌体就按这个protocol了（看到“过夜“俩字，直觉是细胞配液的提取方法）；
另外，您提取过血清exosome吗？洗涤用多少PBS？

seallin

子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

RNA这块我不是很擅长，所以也解决不了你的问题~~祝好运

seallin

子非鱼 发表于 2016-5-4 18:17
谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！ ...

我一般是用PEG8000或者PEG10000，第一次得到的沉淀中加入1mL PBS，千万不要晃，这样重复两次，以去除管壁上的血清，然后再用1 mL PBS重溶，枪头吹打均匀，加入终浓度10% （g/mL）的PEG，4度过夜，第二天离心获得沉淀，沉淀pellet按之前一样，用PBS清洗两遍以去除过量的PEG，最后用RIPA重溶进行破碎……

关键步骤有二点：1）二次沉淀前清洗尽量去除血清；2）二次沉淀后尽量去除PEG；

子非鱼

seallin 发表于 2016-5-3 09:19
很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般 ...

谢谢您回复我，我是用SBI试剂盒，血清外泌体提取后打质谱，结果几乎都是高丰度的白蛋白和IgG，很是崩溃！但是细胞培液提取的exo，得到的蛋白比对ExoCarta等数据库，总体还不错。看到您的帖子，知道您擅长LC-MS这块，所以还想请教：SBI提取250ul血清的exo，kit沉淀要加大剂量PBS清洗然后再沉淀吗？二次沉淀时候加多少PBS？（最近的一片报道说PEG6000可以大量且经济的配制类似于kit的提取液，所以已购买PEG6000，决定拿这个来提取血清exo，并进行二次沉淀，就是不清楚要加多少量PBS二次沉淀来去除那些高丰度蛋白。。。有点啰嗦）
另外，因为也要做RNA深度测序，不知您涉及过吗，我提了2次RNA，总量在250ng左右，全部用来电泳，均没有见到条带。想请问一下问题出在那里，是总血清量少，还是冻存的exo的时候必需加trizo，不加就降解完了？期待您的回复！

seallin

子非鱼 发表于 2016-4-26 20:21
童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么 ...

很抱歉，这段时间没有上论坛。
如果是超离的话，就尽量用多的上样量，因为每次清洗都会有一定损失，一般建议至少2次以上（PBS）；如果是试剂盒，两次沉淀就够了；qEV的话就太浪费了，不划算

子非鱼

seallin 发表于 2016-4-24 15:41
我是专门做质谱的，回答这个问题主要分两点：
1、外泌体的提取。这个很关键，因为外泌体在培养液里，一般质 ...

童鞋好，我最近做了质谱，也发现类似问题，在此有几个问题，向您请教：
1.这里您说要清洗外泌体是指什么方法清洗？是超离之后大量PBS超离清洗？那对于试剂盒提取的外泌体可以用PBS重悬后二次沉淀吗，或者甚至三次沉淀......
2.对于血清外泌体打质谱，如何做到外泌体的清洗呢？
PS：实验室里无超离设备。期待您的回复！

微泡biomarker

感谢大家的回复

seallin

另外，有几个基因名一不小心会出错。比如大名鼎鼎的ALIX，真正的名字应该是PDCD6IP，还要CD225，真名是IFITM1，所以最后搜索可能会有所遗漏。