北京大学医学部：外泌体携带功能性gRNA和Cas9蛋白 - 外泌体之家 | 细胞外膜泡领域核心平台—exosomes & microvesicles—小膜泡大作用

CRISPR / Cas系统是一种有效的基因编辑工具，具有极大的临床应用潜力，尽管存在着递送、脱靶等问题仍需要解决。近日，来自北京大学医学部基础医学院鲁凤民、王杰课题组的研究人员发现，表达CRISPR/Cas9的细胞可以分泌携带功能性gRNA和Cas9蛋白的外泌体，这些外泌体可以向其他组织细胞输送基因编辑活性。外泌体的这一作用虽然可以避免病毒载体系统本身带来的副作用，但由于外泌体的广泛传递性也为这一系统的应用带来了新的风险。这项研究发表于Small杂志上（IF 10.856）。

CRISPR / Cas系统来自于细菌和古细菌的适应性免疫系统，通过在靶基因组基因座处诱导DNA双链断裂（double-strand break，DSB）实现基因组编辑的目的。II 型CRISPR / Cas系统是最简单的系统，由DNA核酸内切酶Cas9、CRISPR RNA（crRNA）和反式激活crRNA（tracrRNA）组成。在工程应用过程中，crRNA和tracrRNA融合成为单一的嵌合向导RNA（gRNA）。CRISPR / Cas9系统目前已被广泛用于编辑人、动物、植物和微生物的基因组。

CRISPR / Cas9系统具有临床应用前景，但是缺乏安全有效的传递系统是一个问题。目前，CRISPR / Cas9系统通常是通过体内病毒载体递送，比如慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒（AAV）载体。然而，病毒载体的可能的细胞毒性、免疫原性和长期表达仍然是临床应用的障碍。最近，一些非病毒传递方法正在开发中，如脂质样纳米粒子、Cas9蛋白/gRNA核糖核蛋白复合物，但它们的稳定性、安全性和效率有限。外泌体是一种纳米级细胞外脂质双层囊泡，直径30 -150nm，广泛用于治疗和诊断应用。例如，肿瘤来源的外泌体在体外通过电穿孔的方式包装CRISPR / Cas9表达质粒，用作CRISPR / Cas9系统的载体。此外，一种脂质体杂交外泌体，所得到的杂合纳米粒子可以有效地将大的CRISPR / Cas9表达质粒包封并递送到靶细胞中。然而，使用CRISPR / Cas9表达质粒通常在靶细胞中对基因组DNA片段的整合出现非特异性编辑。为了更安全地使用CRISRPR / Cas9系统，一些研究报道了使用细胞外囊泡来递送Cas9 / gRNA复合物。例如，通过将Cas9蛋白与ARRDC1连接形成ARRDC1介导的微泡（ARMMs），以及通过用水泡性口炎病毒（VSV-G）的糖蛋白修饰供体细胞形成的携带RNPs的囊泡（VEsiCas），通过这些手段可以模拟病毒感染过程。此外，脱靶效应对CRISPR / Cas9系统的临床应用提出了另一个主要挑战。幸运的是，高保真Cas9（SpCas9-HF1）、增强特异性Cas9（eSpCas9（1.1））和超精确Cas9（HypaCas9）蛋白突变体可以显著减少的脱靶切割。所以用于临床实践的CRISPR / Cas9系统还需要更多的努力。

HepAD38细胞是一种常用的乙型肝炎病毒（HBV）稳定复制细胞模型。在这个细胞中，通过转染HBV特异性gRNA引导的CRISPR / Cas9表达质粒可以抑制多达30％的HBV复制，即使CRISPR / Cas9转染效率仅为10％左右。外泌体可以传递microRNA / lncRNA和细胞蛋白用于细胞间通讯，因此研究人员认为，从HBV特异性CRISPR / Cas9表达质粒转染的细胞分泌的这种细胞外载体（EV）也能够提供CRISPR / Cas9系统，从而向周围的HepAD38细胞扩散这种基因编辑活性。因此，本研究旨在探索天然产生的内源外泌体携带和提供CRISPR / Cas9系统进行基因编辑的能力。

在本研究中，研究人员发现表达CRISPR / Cas9的细胞可以分泌内源外泌体，而gRNA和Cas9蛋白存在于这些外泌体中并从细胞中释放。进一步的实验证明，这些天然产生的内源性外泌体可用作载体，以递送功能性Cas9和乙型肝炎病毒（HBV）特异性gRNA，切割在HBV感染的HuH7细胞中的HBV DNA，或者利用人乳头瘤病毒（HPV）特异性gRNA中切割HeLa细胞中的HPV DNA。该研究证明了内源外泌体作为功能性gRNA和Cas9蛋白的安全有效递送载体的潜力。但是，内源外泌体介导的基因编辑活性向邻近和远端细胞或组织的递送，可能会进一步使CRISPR / Cas9系统的脱靶和安全性问题复杂化。

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