习玉峰 发表于 2015-10-27 21:35:57

exosomes 蛋白鉴定

exosomes RAPI裂解， BCA蛋白定量，总蛋白浓度多大可以用于WB?

惜名 发表于 2015-10-28 09:04:13

按照hzang的经验，只要你exo够纯，加1.5微克蛋白就足以跑出满意的条带。

hzangs 发表于 2015-10-28 09:50:26

惜名 发表于 2015-10-28 09:04
按照hzang的经验，只要你exo够纯，加1.5微克蛋白就足以跑出满意的条带。

我是没有用RIPA 裂解。因为我感觉 BCA蛋白定量的时候，就是二价铜离子被肽键还原成一价铜离子，然后从绿色到紫色， 铜离子是可以过膜的，而SDS-PAGE loading里又有破膜的去垢剂， 所以就直接定量直接loading了 o(╯□╰)o。

如果提的够纯，1.5ug的蛋白，一抗过夜HRP二抗常温1小时（二抗不要叠氮化钠），压片时间10-15min 可以压到很漂亮的条带。我在论坛里秀的exosomes方面的wb图 基本都是这个方法。

luckkit 发表于 2015-10-28 14:34:06

取决于一抗的效价，我用PBS重悬超离沉淀后，BCA定量，取适量直接加load buffer(还原剂加否影响不大，见以前贴)，煮15分钟，冰浴后SDS-PAGE, 最少1ug都出来很好的条带。

熊胖 发表于 2015-10-28 18:21:09

看楼上的，意思是没用裂解液破膜后的蛋白定量的1ug啊。那么破膜后的1ug表现特异性蛋白量应该不够这么好的WB吧。

习玉峰 发表于 2015-11-3 14:52:11

hzangs 发表于 2015-10-28 09:50
我是没有用RIPA 裂解。因为我感觉 BCA蛋白定量的时候，就是二价铜离子被肽键还原成一价铜离子，然后从绿 ...

谢谢很受用，尤其对我这个初学者来说！

惜名 发表于 2015-11-4 09:00:09

熊胖 发表于 2015-10-28 18:21
看楼上的，意思是没用裂解液破膜后的蛋白定量的1ug啊。那么破膜后的1ug表现特异性蛋白量应该不够这么好的WB ...

你的意思是，同一份样本进行裂解和非裂解，所得到的蛋白量会有显著差异？可做过预实验，或有文献支持？

熊胖 发表于 2015-11-4 11:56:32

惜名 发表于 2015-11-4 09:00
你的意思是，同一份样本进行裂解和非裂解，所得到的蛋白量会有显著差异？可做过预实验，或有文献支持？ ...

没有啊 刚开始做 看有人说RIPA+PIC 有人说直接 所以不知道有没影响，先试试吧

旋转的尾音 发表于 2016-4-6 12:47:13

hzangs 发表于 2015-10-28 09:50
我是没有用RIPA 裂解。因为我感觉 BCA蛋白定量的时候，就是二价铜离子被肽键还原成一价铜离子，然后从绿 ...

哪个帖子都能看到大神~~~谢谢~~~
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