kadak007 发表于 2015-5-28 00:26:18

BCA测蛋白浓度问题

请教下各位，从约80毫升胰腺癌细胞培养上清（4个大瓶的量）中提取的外泌体（超速离心法），重悬于约100微升1×PBS，做BCA测蛋白浓度时，
取多少体积外泌体重悬液？
用什么样的裂解液？
用多少体积的裂解液？

有没有比较成熟的方案、或者一些指导原则？非常感谢~


kadak007 发表于 2015-6-2 19:08:17

hexiaoke 发表于 2015-6-2 13:43
不知道楼主后面是怎么做的呢？我也想知道用什么裂解液和取多少体积的裂解液 ...

今天用RIPA裂解液试一下，按1:1加，貌似效果还行

六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06:02

楼主也做胰腺癌？同道中人啊:lol
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着孵育其他细胞观察个现象啥的）
BCA测浓度，裂解液不敢加多了，第一次做都是尝试，我用了30ul裂解液（我现在觉得加10ul裂解液都够了= =），测的蛋白浓度挺低的，
这个貌似没有成熟方案吧，都是摸着石头过河，有结果就成~

niceman1987 发表于 2015-5-28 10:53:29

BCA测蛋白浓度，不应该PBS重悬吧，应该直接加裂解液后检测啊

kadak007 发表于 2015-5-28 14:23:45

niceman1987 发表于 2015-5-28 10:53
BCA测蛋白浓度，不应该PBS重悬吧，应该直接加裂解液后检测啊

谢谢，再请教下，一般你做的是多少量的外泌体对应多少体积裂解液？做BCA时全部加样量多少呢？

niceman1987 发表于 2015-5-28 20:03:21

我还没有进行BCA检测，做完后我们再交流喽

kadak007 发表于 2015-5-28 23:11:23

niceman1987 发表于 2015-5-28 20:03
我还没有进行BCA检测，做完后我们再交流喽

好的，祝实验顺利~

惜名 发表于 2015-5-29 07:58:14

一直用试剂盒的孩子路过。。。
对超离的得率一点概念都没有，坐等版主来回答

kadak007 发表于 2015-5-29 10:10:16

惜名 发表于 2015-5-29 07:58
一直用试剂盒的孩子路过。。。
对超离的得率一点概念都没有，坐等版主来回答 ...

我用细胞培养上清提取的，超离结束后可出现肉眼可见的白色贴壁物

kadak007 发表于 2015-5-29 17:56:31

六月の雪 发表于 2015-5-29 12:06
楼主也做胰腺癌？同道中人啊
我用的SBI试剂，用PBS重悬后，取个10-20ul出来加裂解液（因为剩下的还想着 ...

终于碰到同道了，幸会幸会啊:handshake    我打算下周BCA下
你是用多少体积培养上清提取啊？然后加pbs多少微升重悬呢？是哪种品牌裂解液？
我之前也用SBI试过，完全按说明操作后，并未出现肉眼可见的白色物，象征性的PBS重悬后，电镜下似有似无的有那么几个泡泡。你是怎么处理？

六月の雪 发表于 2015-5-31 13:49:28

kadak007 发表于 2015-5-29 17:56
终于碰到同道了，幸会幸会啊    我打算下周BCA下
你是用多少体积培养上清提取啊？然后加pbs多 ...

40多ML的上清，用超滤管浓缩到5mL，再加SBI试剂过夜才能看到肉眼可见的沉淀，加了200ulPBS重悬，约了下周做电镜，裂解液是长期合作的一家国产公司自配自卖的，不算是什么品牌
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