【Protocols】（胎盘）外泌体纯化与蛋白质组学分析
本帖最后由 Johnny 于 2017-12-6 09:07 编辑分析专题,方法及组学,研究,研究方法 2017-12-05 20:33来源： 已关闭评论 30 编辑
http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/12/sp-207x300.pngMethods in Molecular Biology系列最新一版关于Preeclampsia（子痫前期）的专版中，其中有4篇与外泌体相关。分别介绍了从细胞培养液与体液中富集外泌体、从母体循环中分离胎盘特异性外泌体、利用体外培养人胎盘外植体体系提取胎盘细胞外囊泡、外泌体蛋白质组学分析的方法。一、从细胞条件培养基和生物体液中富集外泌体Sharma, S., et al. (2018). "Methods to Enrich Exosomes from Conditioned Media and Biological Fluids." Methods Mol Biol 1710: 103-115.外泌体这种纳米囊泡可以运输各类分子，包括但不限于蛋白质和miRNA。外泌体的这种能力使其在细胞通讯中有重要作用，会引发靶细胞的生物学变化。它们在促进正常的生物学过程（如免疫应答和怀孕）方面有些功能。然而，它们也与包括癌症和妊娠并发症（如先兆子痫）在内的病理状况有关。要了解外泌体在先兆子痫中的作用，就得建立有效的纯化和表征外泌体的方法。目前已有几种技术提出了浓缩外泌体的方法，如超速离心、密度梯度分离和超滤，但目前没有被广泛接受的最佳技术。这篇文献介绍了使用离心、浮力密度和超滤方法的组合从细胞条件培养基和生物体液中分离外泌体的工作流程。以体液（血清）外泌体富集为例，首先利用常规的梯度离心、超速离心得到富含外泌体的沉淀，如下图，http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/12/sp1.png说明：图中黑圈面积/外圈圆面积代表外泌体的纯度接着将超离的到的含外泌体的pellet通过超滤法或密度梯度离心法进行纯化，http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/12/sp2.png细胞条件培养基外泌体的分离大体雷同，http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/12/sp3.png详细protocol请翻阅原文文献，文中也有很多notes。各文献的大体方法基本一致，超速离心是比较好的富集外泌体的方法、要想得到纯度高的外泌体需进一步用密度梯度离心。小编个人觉得对于Protocol的细节，大家需根据各自实验的具体情况进行调整，不能完完全全依葫芦画瓢，不同细胞的细胞上清品质不一样，不同离心机、甚至同一离心机不同转子操作细节都不一样。二、从母体循环中分离胎盘特异性外泌体的方法Lai, A., et al. (2018). "Optimized Specific Isolation of Placenta-Derived Exosomes from Maternal Circulation." Methods Mol Biol 1710: 131-138.包括胎盘细胞在内的多种细胞均可分泌外泌体。有趣的是，胎盘细胞分泌的外泌体早在妊娠6周就已在母体循环中被发现，其浓度随胎龄增加而增加。虽然人们越来越有兴趣阐明在正常和复杂的妊娠（如先兆子痫）中外泌体的作用，但由于不能从胎儿外周分离胎盘外泌体而导致该领域的进展被推迟。因此，这篇文献描述了一个从母体循环中分离胎盘外泌体的工作流程。侵入人类白细胞抗原-G+（HLA-G+）绒毛滋养层细胞（EVT）是胎盘锚定基础，是子宫螺旋动脉开放以及防止母体对外来胎儿和胎盘组织产生免疫攻击的关键因素。孕早期，EVT与母体循环直接接触；因此，EVT衍生的外泌体可能存在于母体循环中。已经发现胎盘来源的外泌体具有合胞体滋养层特异性蛋白——胎盘碱性磷酸酶（PLAP）。此外，研究已经确定PLAP阳性外泌体仅存在于孕妇的循环中。这篇文献描述了一种通过免疫亲和捕获法从母体循环中分离胎盘外泌体的方法，使用抗HLA-G和抗PLAP包被的珠分离绒毛外滋养层细胞（HLA-G+）和合体滋养层细胞（PLAP+）分泌的外泌体。三、利用体外培养人胎盘外植体体系提取胎盘细胞外囊泡Tong, M. and L. W. Chamley (2018). "Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Ex Vivo Cultured Human Placental Explants." Methods Mol Biol 1710: 117-129.人胎盘外植体的离体培养为胎盘学家研究胎盘在整个妊娠期间分泌的可溶性因子的环境提供了基础，同时可保持胎盘绒毛的正确的三维结构。这篇文献详细介绍了使用胎盘外植体培养方法收集由人类胎盘释放的细胞外囊泡的方法，包含从妊娠6周起的整个怀孕期间。使用这种方法，可以从每个胎盘样品同时收集至少三个不同的胎盘细胞外囊泡群，从而可对由人类胎盘产生的不同类型的细胞外囊泡的成分和下游效应进行比较分析。对于研究胎盘外泌体的童鞋们，上面这2篇文献应是必读文献吧。四、外泌体蛋白质组学分析Lai, A., et al. (2018). "Proteomics Method to Identification of Protein Profiles in Exosomes." Methods Mol Biol 1710: 139-153.母体循环中存在的外泌体水平在先兆子痫怀孕中较高，并且其蛋白质含量分布响应于微环境而变化。通过发现候选生物标志物，基于质谱（MS）的蛋白质组学可以更好地理解怀孕相关疾病的病理生理学。随着样品制备技术、计算方法学和生物信息学的进步，基于MS的蛋白质组学已经解决了鉴定和量化来自各种复杂生物样品的数千种蛋白质和肽的挑战。尽管对生物标志物诊断的兴趣越来越浓，生物基质（例如血浆）的复杂性质对候选生物标志物发现提出了挑战。这篇文献描述了一个制备用于蛋白质组学分析的外泌体的工作流程。做外泌体蛋白质组学分析的小伙伴们可以看看这篇文献。
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