向荣y
发表于 2015-4-26 19:01:37
Johnny 发表于 2015-4-20 14:19
换48孔板试试?还有多测几种可能对肿瘤细胞的影响,不要限于MTT,比如migration等其他肿瘤相关的指标 ...
嗯嗯 只是提出来的外体太少 不太够用的~
木瓜31
发表于 2015-6-25 12:58:18
丁倩倩 发表于 2015-4-19 21:43
惜名师哥已经说得很详细了,你做干预的话不用裂解,直接用提取的exosome用BCA(或其他方法)测浓度就好, ...
不裂解直接用exosome重悬液测蛋白浓度,会比裂解后再测浓度低吗?
丁倩倩
发表于 2015-6-25 16:28:29
我做的一般都是裂解后的浓度偏低
kadak007
发表于 2015-6-25 23:38:02
丁倩倩 发表于 2015-6-25 16:28
我做的一般都是裂解后的浓度偏低
惜名在5楼回复时写到:“譬如,你有100ul PBS-exo,经裂解后测蛋白浓度,计算出这100ul PBS-exo共含有20ug蛋白(假设)。那么,这100ul PBS-exo加到六孔板中的1个孔(2ml培养基)中,即得到10ug/ml的外泌体干预浓度了。”
仔细读完后,感觉他还是分两步走的,同时提2批等量的exo,1批裂解后测浓度;明确浓度后,另一批处理细胞。
kadak007
发表于 2015-6-25 23:44:19
惜名 发表于 2015-4-19 10:46
10ug/ml是指,每ml培养上清中加入10ug以蛋白衡量的外泌体。
这牵扯到一个外泌体浓度计算的问题,目前认为 ...
请教下,pbs-exo冻存于 --80℃,溶解后还能用来处理细胞吗?效果怎样呢?
谢谢~
惜名
发表于 2015-6-26 07:57:17
kadak007 发表于 2015-6-25 23:44
请教下,pbs-exo冻存于 --80℃,溶解后还能用来处理细胞吗?效果怎样呢?
谢谢~ ...
可以的,效果和新提的差不多,但是你不能在-80度放太久。
我个人经验,2-4周问题不大的。因为每次提出来量都很少,所以很快就用完了
也有人说可放数月。。。
kadak007
发表于 2015-6-30 15:42:34
惜名 发表于 2015-6-26 07:57
可以的,效果和新提的差不多,但是你不能在-80度放太久。
我个人经验,2-4周问题不大的。因为每次提出来 ...
处理细胞前,exo裂解后BCA测浓度,exo不裂解直接测浓度,这两种做法各有什么讲究吗?
kadak007
发表于 2015-6-30 16:35:05
你好,请教下,做exo处理细胞时,每个孔里加多少细胞合适呢?总共需达到多大体积比较好呢?
譬如,25cm2规格培养瓶铺满时,细胞数大概是4-5*10^6,将这些细胞重悬于3ml的培养基,取多少加到孔里合适呢?
惜名
发表于 2015-7-1 08:22:11
kadak007 发表于 2015-6-30 15:42
处理细胞前,exo裂解后BCA测浓度,exo不裂解直接测浓度,这两种做法各有什么讲究吗?...
是否需要裂解这个问题我看到论坛里有人讨论过。。。
这个我也搞不清楚,反正我每次都是裂解的,不管是测浓度还是跑western
惜名
发表于 2015-7-1 08:26:53
kadak007 发表于 2015-6-30 16:35
你好,请教下,做exo处理细胞时,每个孔里加多少细胞合适呢?总共需达到多大体积比较好呢?
譬如,25cm2规 ...
我做HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的炎症反应,目测细胞密度50-95%的范围内都可以。
25cm2的瓶子面积为六孔板的2倍多一点,我手头的资料提示25cm2瓶子可以获得5*10^6个细胞,六孔板大约是2.5*10^。这样计算你1个瓶子分2个孔还是比较合适的。
当然,你能先摸一下条件是最好的。