protocol丨外泌体免疫胶体金电镜经验分享
本帖最后由 hzangs 于 2017-5-18 19:06 编辑版权所有，未经作者授权禁止转载。
最近在论坛、微信QQ群里很多同仁都在问外泌体免疫胶体金电镜的事情，刚好前段时间我尝试做了一下，给大家分享一下我这次做的一些经验（ps我不是大神hzangs哈哈）。
外泌体的电镜是鉴定外泌体形态大小的一个常规手段，但对于研究外泌体表面蛋白或者更确切的去鉴定外泌体则需要通过电镜来观察蛋白质在外泌体中的位置，就需要做外泌体免疫胶体金电镜了。比如我们可以检测一些外泌体特征表面marker如CD9、CD63等在外泌体上的位置，从而确定你的电镜打到的是外泌体。或者研究外泌体的新表面marker的研究同仁们，需要用免疫胶体金电镜鉴定该蛋白是否在外泌体上。举几个栗子：
http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/05/immunogold-labeling-exo1.png
图源 Sonia A. Melo, et al. Nature.
http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/05/immunogold-labeling-exo2.png
图源 Jaffre J. Athman, et al. J Immunol.
由于我也是第一次做，也没有别人的经验可供参考，所以基本上就按照Thery大神2006年的protocol进行的（Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids，相信大家都有这篇文献，如需下载戳http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=803）。
http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/05/QQ20170518-0.png
第14页这部分
以下是我做的一个大致的protocol：1. 外泌体的提取（最好做过电镜检测）。我认为做免疫电镜的外泌体的质量要求还是比较高的，不管是超离还是用商业化试剂盒，要保证在电镜下的密度适当，形态容易分辨。关于普通电镜的做法，由于负染试剂的不同大家的做法也不尽相同，论坛上相关帖子也比较多，我是按照大（dou）神（bi）hzangs的醋酸双氧铀负染方法做的：http://www.exosome.com.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=173http://www.exosomemed.com/1030.html2. 其他试剂材料准备PBS重悬的外泌体4%(w/v) 多聚甲醛（PFA）PBS50mM甘氨酸/PBS封闭液：5%(w/v) BSA/PBS一抗（被检测的蛋白抗体）一抗稀释液：1%(w/v) BSA/PBSwash buffer：0.1%(w/v) BSA/PBS连接有胶体金的二抗（ps：thery的方法里胶体金颗粒单独的，需要加一步胶体金的连接过程，我没做过大家可以补充）二抗稀释液：0.5%(w/v) BSA/PBS1%戊二醛溶液电镜用的铜网或碳网（我用的碳网）3. 将外泌体溶液和4%PFA按1：1混合（总体积10-20ul足够），滴在干净的塑料薄膜上形成液滴，然后将电镜碳网的正面扣在液滴上，放置20min。大概是这样：http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/05/yediwmt.jpg4. 将碳网放置于100ul PBS液滴上，洗两次，每次3min。5. 将碳网放置于100ul 50mM甘氨酸液滴上，3min，重复3次。6. 封闭：将碳网放置于100ul 5% BSA封闭液上，封闭10min。7. 一抗用一抗稀释液进行稀释（我用的1:20，较浓，好在用量不大），碳网置于20ul一抗液滴上孵育30min。8. 将碳网置于100ul wash buffer液滴上，3min，洗6次。9. 标记有胶体金的二抗（抗鼠、兔等与一抗对应）按1:20稀释，碳网放置其上30min。10. 碳网置于 0.5 BSA 100ul液滴，3min，洗6次。11. 碳网置于100ul PBS液滴上，2min，洗6次。12. 碳网置于100ul 1%戊二醛液滴上，放置2min。13.碳网置于100ul 去离子水液滴上，2min，洗6次。14. 10ul醋酸双氧铀负染90s，烤干碳网，上机检测。（大家用其他方法负染鉴定外泌体的都可以，确定好用就行）
所以整个实验过程和步骤基本上就是按照英文的protocol来做的，仅仅是在个别地方根据我们自己的实际情况做了一些微调。我做的是一个定位于膜表面的一个蛋白分子，电镜检测下来视野里标记有胶颗粒的外泌体还是比较多的，如下图所示。但是我也做了另外一个膜蛋白却没有检测到，可能需要调整一些实验条件比如抗体浓度等。
http://www.exosomemed.com/wp-content/uploads/2017/05/yediwmt2.jpg
欢迎有做过外泌体免疫胶体金电镜的同仁给出指正，可在下方留言，大家一起讨论。有问题的同仁们也可以留言一起讨论解决。
非常感谢分享步骤，有机会试试方法。 谢谢分享，正想要做这个试试 谢谢分享步骤哈。但是我不知道5步的滴加甘氨酸什么原因那？我做过一次没有5步骤，之间是吸附样品在铜网上，封闭，一抗，二抗，2%磷钨酸染色。 请问北京胶体金电镜在哪里可以做？ 感谢分享，想问一问大佬这个电镜用的外泌体是不是最好新鲜提取的，保存一段时间以后是不是外泌体的表面蛋白会降解一些 请问免疫胶体金二抗是从哪个公司购买的 马克，感谢楼主 请问一下，我现有做WB的一抗，CD63和CD81的，能用来做电镜的一抗吗？ 白天的星星 发表于 2021-1-7 19:49
请问一下，我现有做WB的一抗，CD63和CD81的，能用来做电镜的一抗吗？
请问您后来这个问题解决了吗？可以用吗？
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