exosome-free FBS的制备策略及使用技巧
版权归属外泌体之家，转载请注明出处：外泌体之家exosome-free FBS的制备策略及使用技巧最近坛子里有几位朋友询问exosome-freeFBS的制备方法，hzangs在每个帖子都做了回答。为了方便大家了解这方面的技巧，hzangs在这里做一个略微的总结并提供一份简要的protocol给大家参考。面对诸多大牛，可能我的叙述有不严谨的地方，班门弄斧还请各位多多指正。
很多朋友目前都在尝试从细胞培养上清中分离外泌体，这就存在一个问题：使用正常培液养细胞再换无血清培液收外泌体，还是直接使用exosome-free FBS配制培液用于培养细胞收外泌体？hzangs打开自己endnote里的文献集，从上自下打开数篇CNS及子刊的paper，参考了一下（PMID：24735924、25417103、25985394、26524530、26106858），所有的这些CNS及子刊的paper均是使用exosome-free FBS培养细胞再收上清分离exosomes的。由此可见，在高质量的paper里，大家更倾向于使用含有exosome-free FBS培液来培养细胞收上清分离exosomes。至少肿瘤研究方面是这样的！
既然很多高质量的paper都在使用exosome-freeFBS配制的培液培养细胞收外泌体。作为追风者的我虽然没有能力发这些高质量的paper，但是单位里还是有设备让我在方法上接近高质量paper的。自我安慰一下，哈哈！
废话这么多，那就开始分享一下一些paper里提到过的使用超速离心机制备exosome-free FBS的方法吧。目前常见的有两种方法，一种是先配置20%FBS的培液，然后培液超速离心去除exosomes后用于细胞培养，另一种是直接FBS长时间超速离心去除exosomes后再用于配制培液养细胞。考虑到工作量以及机器的使用频率，hzangs选择了后者，当然这也是很多paper里选择的方法。下面我就来分享一下大概的制备流程。至于分离效果，我们在最后秀数据讨论。如何使用这些exosome-free FBS 我们也在后面说。
材料及设备：FBS、超速离心机、超速离心机转子、50ml离心管、0.45um滤器、10ml或20ml注射器。1、你需要将FBS融化成液体，这是必须的。2、之后你需要将FBS分装到超速离心管中，上机超离120000g 14-16h。PS:一般hzangs会在这一步选择过夜超离，因为晚上使用超速离心机的人很少很少，这样既不会耽误别人的实验，也节省自己的时间。3、你需要收集离心管里约90%的上清。注意，这里不要倒，一定要使用移液器从上方吸出来。最好用十几毫升的那种pipette，方便省时还易操作。你需要贴着液面吸取FBS，以避免扰动底部的沉淀，请参见下图：
（PS：大家有没有被hzangs的绘画功底所折服，反正我自己已经被折服了，大家就凑合看吧。 哈哈哈哈哈哈）
4、转移到50ml离心管的FBS混匀后使用0.45um的滤器过滤即可得到无菌的exosome-free 的FBS。冻起来，随用随取。
每次制备会有10%的血清损耗，这是不是太浪费了！！！先别急着扔。这部分血清还有其他用处。你可以收起来备用。依据hzangs的师弟实践得出真知，这部分血清可以用于冻存细胞，或者有哪些细胞状态不好，可以用这部分血清配制培液养一养，细胞会长得生龙活虎，明显比一般的FBS培养的细胞涨势迅猛！
可能还有朋友比较担心，这样制备的exosome-free FBS是否会残留大量的exosomes。我们可以参考一下beckman所提供的数据。这个数据上可以看出，超离后的FBS含有的粒子数目明显低于普通FBS，与商品化的exosome-free FBS相近。
培养细胞收上清很麻烦。该如何操作比较简便呢？hzangs分享一下自己的方法给大家作参考。以培养肿瘤细胞为例。通常会先铺50%密度的细胞到培养皿中，然后加入exosome-free FBS配制的培液，培养72小时。hzangs的细胞刚好是72h从50%长到100%，之后吸取上清用于外泌体分离，细胞消化下来继续按照50%的密度铺板，继续使用exosomes-free FBS配制的培液培养，72h后就又可以收一次了。
Hzangs的分享到此结束。有实验条件的朋友可以尝试一下。如有其它问题，大家可以到坛子里的同名贴下留言给我。谢谢大家~
画风清奇，有B站之风。。这贴纯干货啊。 stones 发表于 2016-7-26 22:51
画风清奇，有B站之风。。这贴纯干货啊。
{:3_62:}谢谢~~ 首先，感谢楼主的干货分享！！！就需要这样的帖子！还想问楼主一个小问题，就是楼主超速离心时所用的离心机转子和离心管，之前买的离心管没盖子，做不到无菌。 顶一下，学习到了！0.45μm过滤是除菌的对吗？实验室有0.22μm的滤膜，是不是也可以用了 ashey 发表于 2016-7-27 09:20
首先，感谢楼主的干货分享！！！就需要这样的帖子！还想问楼主一个小问题，就是楼主超速离心时所用的离心机 ...
你只要尽可能保证无菌就可以。 毕竟后面要过0.45um滤器的。你可以用酒精泡一下和血清接触的东西并用灭菌PBS洗一洗 Aurorachen 发表于 2016-7-27 09:26
顶一下，学习到了！0.45μm过滤是除菌的对吗？实验室有0.22μm的滤膜，是不是也可以用了 ...
最好用0.45um的 尽可能少的损耗血清中的有效成分 请问有人提取过肿瘤细胞上清外泌体吗？大概能提取到多少外泌体呢？ wanganbang 发表于 2016-7-27 10:27
请问有人提取过肿瘤细胞上清外泌体吗？大概能提取到多少外泌体呢？
不同的细胞 提取量不同的。 请问有人提取过肿瘤细胞上清的外泌体吗？大概能提取多少呢？